生物植物DNARNA及蛋白的提取与分析

植物DNA、RNA及蛋白

提取与分析第1页植物DNA提取第2页DNA提取标准确保DNA结构完整性排除有机溶剂和金属离子污染排除其它核酸分子污染蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度纯化后不应存在对酶抑制性物质第3页植物DNA提取方法CTAB法SDS法煮提法

--植物DNA提取经典方法第4页DNA提取基本步骤材料准备（新鲜或冷冻保留）细胞裂解（液氮研磨，释放内容物）DNA分离与纯化（酚氯仿抽提）DNA沉淀与洗涤（2V无水乙醇或2/3V异丙醇）DNA干燥与溶解（ddH2O或TE）第5页CTAB法流程离心洗涤植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解沉淀第6页CTAB提取液主要成份

CTAB：十六烷基三甲基溴化铵，是一个阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物，经过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。Tris-HCl(pH8.0):提供一个缓冲环境，预防核酸被破坏。EDTA:螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性。NaCl:

提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中。第7页

1.取约0.1g水稻叶片在液态中磨成粉末，将适量粉末材料转移至1.5mlEP管中。2.加入600µl预热（95℃）1.5×CTAB缓冲液，然后65℃温浴20~60min。3.取出EP管，冷却后加入600µl氯仿:异戊醇（24:1）混合均匀，然后10000rpm离心10min，取出后吸收上清液到另一新EP管中。4.加入2/3V异丙醇或2V无水乙醇混合均匀，冰浴至DNA丝状物出现。5.稍微离心沉淀DNA，倒掉上清液。6.加入600µl75%乙醇洗涤，放置30min。7.倒掉上清液，室温下吹干DNA。8.加入100µlTE溶解DNA。9.取5-10ul电泳检测提取效果10.-20℃下贮存备用CTAB法步骤第8页注意事项1.全部用具均需要高温高压，以灭活残余DNA酶。2.全部试剂均用高压灭菌双蒸水配制。3.在提取过程，应尽可能在温和条件下操作,如尽可能降低酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓,以确保得到较长DNA。第9页DNA质量检测电泳带型单一无拖尾现象点样孔无残留杂质OD值测定

DNA纯品OD260/OD280为1.8，若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余盐存在。第10页植物RNA提取第11页分离RNA目标RT-PCRNorthernblot构建cDNA文库GeneChips体外翻译第12页RNA提取关键--预防RNase降解RNA试验失败主要原因是RNA酶污染。RNA酶广泛存在而稳定，普通反应不需要辅助因子。研究人员手、唾液、灰尘、器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、各种试剂及各种组织和细胞中。RNA酶可耐受各种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。RNA制剂中只要存在少许RNA酶就会引发RNA在制备与分析过程中降解，而所制备RNA纯度和完整性又可直接影响RNA分析结果，所以RNA制备与分析操作难度极大。在试验中，首先要严格控制外源性RNA酶污染；另首先要最大程度地抑制内源性RNA酶。第13页1.耐高温器具（如玻璃制品、研钵、剪刀、镊子等）于180℃下干烤8h2.塑料耗材（Tip、EP管等）用0.1%DEPC水浸泡过夜，然后高压，再烤干备用3.试验用氯仿、乙醇为RNA专用，水为DEPC处理水4.使用有效RNase抑制剂：如异硫氢酸胍、RNasin5.配制溶液应尽可能用0.1%DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留DEPC。不能高压灭菌试剂，应该用DEPC处理过无菌双蒸水配制6.试验过程需带一次性塑料手套且经常更换7.设置RNA操作专用试验室，全部器械等应为专用。

注意：DEPC有致癌之嫌，必须小心操作，预防接触与吸入！预防RNase污染办法第14页惯用RNase抑制剂DEPC(焦磷酸二乙酯):是一个强烈但不彻底RNA酶抑制剂。它经过和RNA酶活性基团组氨酸咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶活性。异硫氢酸胍∶当前被认为是最有效RNA酶抑制剂，它在裂解组织同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈变性作用。RNasin(RNA酶蛋白质抑制剂）一个非竞争性抑制剂，能够和各种RNA酶结合，使其失活氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶活性。其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。第15页1.胍盐法：用异硫氰酸胍或盐酸胍和-巯基乙醇变性蛋白，并抑制RNase活性，经酚氯仿抽提后再沉淀。2.氯化锂沉淀法：因为锂在在一定pH下能使RNA相对特异地沉淀，但轻易使小分子RNA损失，而且残留锂离子对mRNA有抑制作用。3.苯酚法：用SDS变性蛋白并抑制RNase活性，经屡次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAC和乙醇沉淀RNA。分离总RNA方法第16页TRI

Reagent提取总RNA

TRIReagent含有异硫氰酸胍和苯酚，能够有效溶解RNA，DNA和蛋白质。在加入氯仿并离心后，上层水相中含有RNA。水相RNA经过沉淀和洗涤后几乎没有DNA或者蛋白质污染第17页TRI

Reagent提取步骤1.研钵研杵预冷后,加入少许样品用液N快速研磨成冰粉状2.将样品（样品量不超出100mg)移入1.5mlEP管中,快速加入1mlTRIReagent混匀,室温静置5min3.加0.2ml氯仿,猛烈振荡15S,室温静置10min4.4℃,1g,15min;取上清于另一EP管中，加0.5ml异丙醇混匀，室温静置10min5.4℃,1g,8min；去上清，加1ml75%乙醇，涡漩沉淀6.去75%乙醇，室温晾干5~10min7.加30~50ulDEPC-H2O溶解8.电泳检测提取RNA质量第18页注意事项材料新鲜，冷冻材料切忌重复冻融，如要屡次提取，分成多份保留（液氮长久保留，－70℃短期保留）先用液氮研磨植物材料，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮研磨后马上加裂解液裂解，样品与裂解液充分接触前防止融化样品量适当，确保充分裂解，样品量过多会使内源性RNase抑制不完全，造成RNA降解在使用氯仿抽提纯化时，要充分混匀，动作快速RNA晾干时不要过干，会造成难溶试验过程必须严格预防RNsae污染

第19页电泳试验吸光度测定保温试验

质量分析电泳目标是在于检测28S和18S条带完整性和他们比值假如28S和18S条带明亮、清楚、条带锐利（指条带边缘清楚），而且28S亮度在18S条带两倍以上，认为RNA质量好第20页电泳试验吸光度测定保温试验

质量分析

280、320、230、260nm下吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物值。普通只看A260/A280（R）。R=1.8~2.0，说明提取RNA可用，R<1.8时，溶液中蛋白或者时其它有机物污染比较显著，当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。

假如RNA量够，可在260nm（A260）用分光光度法测定RNA得率，1个单位等于40ug/mlssRNA。纯RNAA260/A280比值为2.0。

第21页电泳试验吸光度测定保温试验

质量分析检测极残留少许RNase污染按照样品浓度，从RNA溶液中吸收两份1000ngRNA加入至0.5ml离心管中,而且用pH7.0Tris缓冲液补充到10ul总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃恒温水浴中,保温1h。另一份放置在-20℃冰箱中保留1h。时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较二者电泳条带。假如二者条带一致或者无显著差异，则说明RNA溶液中没有残留RNA酶污染，RNA质量很好。相反，假如70℃保温样本有显著降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染第22页植物蛋白提取第23页蛋白制备1.选择材料和预处理2.细胞破碎及细胞器分离3.提取和纯化4.浓细、干燥和保留第24页蛋白提取方法（一）水溶液提取法

稀盐和缓冲系统水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最惯用溶剂，通惯用量是原材料体积1-5倍，提取时需要均匀搅拌，以利于蛋白质溶解。提取温度要视有效成份性质而定。首先，多数蛋白质溶解度伴随温度升高而增大，所以，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另首先，温度升高会使蛋白质变性失活，所以，基于这一点考虑提取蛋白质普通采取低温（5度以下）操作。为了防止蛋白质提以过程中降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。

第25页1、pH值

蛋白质，酶是含有等电点两性电解质，提取液pH值应选择在偏离等电点两侧pH范围内。用稀酸或稀碱提取时，应预防过酸或过碱而引发蛋白质可解离基团发生改变，从而造成蛋白质构象不可逆改变，普通来说，碱性蛋白质用偏酸性提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性提取液。

2、盐浓度

稀浓度可促进蛋白质溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，含有保护蛋白质不易变性优点，所以在提取液中加入少许NaCl等中性盐，普通以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采取0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。第26页（二）有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢靠或分子中非极性侧链较多蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具一定亲水性，还有较强亲脂性、是理想提脂蛋白提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密蛋白质和酶尤其优越，一是因为丁醇亲脂性强，尤其是溶解磷脂能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引发酶变性失活。另外，丁醇提取法pH及温度选择范围较广，也适合用于动植物及微生物材料。蛋白提取方法第27页我们试验室方法(1)取100mg植物叶片,加提取缓冲液PBS1ml和少许石英沙研成匀浆，转移到1.5mlEP管中。(2)10,000g/min4度离心15min,取上清液放置4度冰箱备用。第28页总蛋白测定Bradford法：配制考马斯亮兰G-250蛋白显色液，其组成为：0.01％(w／v)考马斯亮兰G-250，4．7％(w／v)乙醇，8．5％(w／v)磷酸。以标准蛋白做蛋白浓度与OD值间标准曲线，取待分析蛋白溶液于考马斯亮兰G-250显色液中，测其OD值，依据标准曲线即知待分析蛋白液中蛋白浓度。第29页讨论？第30页1、样品不纯2、样品降解3、样品得率低4、样品电泳时检测不到条带第31页一、DNA样品不纯1.DNA中含有蛋白、糖类、酚类杂质2.DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3.DNA中残留有金属离子1.重新抽提DNA，去除蛋白、糖类、酚类等杂质2.重新沉淀DNA，让酒精充分挥发后再溶解3.增加70％乙醇洗涤次数（2-3次）

原因对策第32页二、DNA降解1.材料不新鲜或重复冻融2.未很好抑制内源核酶活性3.提取过程操作过于烈，DNA被机械打断4.外源核酸酶污染5.DNA重复冻融1.尽可能取新鲜材料，低温保留材料防止重复冻融2.液氮研磨组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液；提取内源核酸酶含量丰富材料DNA时，可增加裂解液中螯合剂含量3.细胞裂解后后续操作应尽可能轻柔4.全部试剂用无菌水配制，耗材经高灭菌5.将DNA分装保留于缓冲液中，防止复冻融对策

原因第33页1.试验材料不佳或量少2.破壁或裂解不充分3.沉淀不完全4.洗涤时DNA丢失1.尽可能选取新鲜（幼嫩）材料2.液氮研磨充分，适当延长裂解时间3.-20℃下低温沉淀；延长沉淀时间；加辅助物（NaAC或NaCl)，促进沉淀4.洗涤时要小心对策

原因三、DNA提取量少第34页四、RNA易降解1.样品不新鲜或样品保留不妥，RNA降解2.污染了RNase1.尽可能取新鲜样品，取后马上放入液氮中保留2.认真处理对应器具和试剂，严格地操作

原因对策第35页五、RNA样品不纯1.抽提过程不彻底，存在蛋白等杂质污染2.DNA污染3.离子浓度过高

1.确保彻底裂解和一定转数一定时间离心；增加有机溶剂抽提次数2.抽提后取上清时勿吸收中间相，加入不含RNaseDNase处理3.增加70％乙醇洗涤次数

原因对策第36页六、RNA得率低1.样品过量或样品裂解和研磨不彻底2.RNA未有效沉淀1.降低样品用量，充分研磨样品，增加裂解液用量和裂解时间2.延长沉淀时间和提升离心转速和离心时间

原因对策第37页七、RNA电泳检测不到条带1.RNA没溶解好2.高电压电泳，产生较高热量，使胶温度过高1.RNA晾干时不要过干，会造成难溶2.把胶放到冷水中冷却后再观察

原因对策第38页

谢谢！第39页我劝一个草率结婚朋友离婚。她平静告诉我，假如说当初鲁莽结婚是个错误。那么，现在草率离婚是一错再错。这位朋友以后还是离婚了，大家一致认为她行为很理性。

一样故事正在互联网搜索巨头谷歌身上发生，不过谷歌选择了草率“离婚”。

饮鸩止渴

因为急于抑制苹果iphone手机翻天覆地产业冲击，谷歌采取急功近利粗糙型开放策略。饮鸩止渴策略一时取得了结果。市场研究企业尼尔森最近公布数据显示，在经过VerizonWireless、AT&T和SprintNextel三大运行商经销后，谷歌Android手机在美国市场上销售量已经超出iPhone。另一家市场研究企业iSuppli甚至认为，全球范围内使用Android操作系统手机数量将在年超出苹果iPhone。

表面繁荣背后，是Android生态系统一团糟，谷歌正在为自己粗放型开放策略买单。

用户对谷歌手机态度从开始好奇、以后犹豫，变成强烈批评。“大多Android手机程序都是垃圾，乱七八糟”，一位手机发烧友快速投奔了iphone阵营：“一样植物人大战僵尸游戏，在谷歌手机和iphone手机上体验简直没法比”

混乱，还是混乱。一切一切乱象，折射出谷歌已经失去对Android生态系统控制。这一切根源，我判断是开放策略早期过于宽松，造成失去控制权。混乱生态系统表现在用户手机上，就是应用程序混乱和粗燥。

一错再错

为此，谷歌开始采取对策。最近，有国内厂商称新Android3.0开始关闭应用程序API(应用程序编程接口)，统一Android界面。这意味着，谷歌将放弃其初始开放策略，开始封闭管理。

粗看之下，谷歌认识到自己错误。既然是过分开放造成错误，那么收紧开放尺度是很自然逻辑，无懈可击。但我认为，谷歌仓促收紧开放策略依然是个错误。打个比喻。假如过分开放政策是草率结婚，那么草率封闭就是草率离婚。这么判断原因很简单，谷歌把Android开放出去那一天，Android已经不属于谷歌。谷歌没有认识到这一点，还认为Android只是自己。

合作搭档对谷歌封闭政策反应加强了我判断结论。经济观察报报道，国内第一家生产基于Android平台手机设计企业创杨通信，近日已经被迫出售。创杨通信责任人给出出售理由是，“因为不愿意甘当炮灰而选择放弃。”

按照当前Android3.0将统一界面想法，未来手机市场将出现毫无差异化产品。这对于企业来说，几乎意味着不可防止价格战。利润空间微薄，造成合作搭档生存环境恶劣。于是大量退出几乎是一个必定。

除了为合作搭档找到新利益空间，谷歌还将面临开放阵营精神层面声讨，这对谷歌挑战会更大。假如说谷歌为了自己竞争私利利用了开放，赢得了名声。那么，谷歌不能一脚把开放踢开，他现在还需要为这种名声买单。

假如只顾自己收网，谷歌会被面临铺天盖地道德训斥。谷歌，希望你准备好了，三思而行。

木桶效应就是指一个水桶不论有多高，它盛水高度取决于其中最低那块木板。这在选购手机时候也一样适用。尤其是很多用户在购置手机时候，都会专注于某一个参数，比如要求处理器主频要高达1GHz，但一部手机整机表现是由多个原因组成，所以在购置手机时候一定要从整体角度上来看一部手机性除了处理器主频以外，其实还有很多影响整机表现元素，比如运行内存(RAM)、机身内存(ROM)、操作系统、厂商对系统优化都会有所影响。不过在很多用户眼中，这几项却远没有处理器主频主要。而假如忽略这几项话，可能买到一个主频很高，但整机性能却依然不令人满意机型。

用户在选机过程中切勿只关注一个硬件参数，这么很可能并不能买到一款理想机型，就算买手机主频再高，运行内存低话依然无法同时运行数个程序、机身内存小话则无法把太多软件安装到机器上，这对整机耗电和运行速度方面都有所影响、而厂商优化更是决定着一部手机稳定性和部分运行速度。综上所述，大家在选购手机时候一定要综合考虑一款手机硬件规格。除此之外，也不要把硬件看太过主要，就比如苹果iPhone3GS在硬件配置上并不出众，但却在操控手感以及软件资源上当前难有机型企及。更高分辨率能取得更为逼真细腻显示效果，所以对于屏幕分辨率绝大多数人都会偏向于分辨率更高机型。但对于笔者所说高分辨率未必是好事会有所怀疑。其实这里说高分辨率“不好”更多是指采取非主流高分辨率机型。在以前，就有几款“悲情”机型在分辨率上吃了不小亏。

大名鼎鼎HTCDiamond就是一款颇具代表意义机型，Diamond上市手机市场还处于QVGA时代、只有少数旗舰机皇采取WVGA这么级别屏幕，因为HTCDiamond却采取了VGA这一过渡型分辨率，而也正是因为这一点，Diamond很多软件都未有支持或无法完美运行，可谓是一个不小遗憾。除此之外，曾经非常经典

第40页附赠人生心语人生太短，聪明太晚人生太短，聪明太晚(1)

我们都老得太快

却聪明得太迟把钱省下来，等候退休后再去享受结果退休后，因为年纪大，身体差，行动不方便，哪里也去不成。钱存下来等养老，结果孩子长大了，要出国留学，要创业做生意，要花钱娶老婆，自己退休金都被拗走了。人生太短，聪明太晚(2)

当自己有足够能力善待自己时，就立刻去做，老年人有时候是无法做中年人或是青少年人能够做事，年纪和健康就是一大原因。小孩子从小就告诉他，养你到高中，大学以后就要自立更生，要留学，创业，娶老婆，自己想方法，自己要留多一点钱，不要为了小孩子而活我们都老得太快却聪明得太迟，我学长去年丧妻。这突如其来事故，实在叫人难以接收，不过死亡到来不总是如此。学长说他太太最希望他能送鲜花给他，不过他以为太浪费，总推说等到下次再买，结果却是在她死后，用鲜花布置她灵堂。这不是太蠢愚了吗？！等到......、等到.....，似乎我们全部生命，都用在等候。人生太短，聪明太晚(3)

「等到我大学毕业以后，我就会怎样怎样」我们对自己说「等到我买房子以后！」「等我最小孩子结婚之后！」「等我把这笔生意谈成之后！」「等到我死了以后」人人都很愿意牺牲当下，去换取未知等候；牺牲今生今世辛劳钱，去购置后世安逸在台湾只要往有山道路上走一走，就随地都可看到「农舍」变「精舍」，山坡地变灵塔，无非也是为了等到死后，能图个保障，无须再受苦。许多人认为必须等到某时或某事完成之后再采取行动。明天我就开始运动，明天我就会对他好一点，下星期我们就找时间出去走走；退休后，我们就要好好享受一下。人生太短，聪明太晚(4)

然而，生活总是一直变动，环境总是不可预知，现实生活中，各种突发情况总是层出不穷。身为一个医生，我所见过死人，比普通人要来得多。这些人早上醒来时，原本预期过是另一个平凡无奇日子，没想到一个意料之外事；交通意外、脑溢血、心脏病发作等等。剎那间生命巨轮倾覆离轨，突然闯进一片黑暗之中。那么我们要怎样面对生命呢？我们毋需等到生活完美无瑕，也毋需等到一切都平稳，想做什么，现在就能够开始做起。

一个人永远也无法预料未来，所以不要延缓想过生活，不要吝于表示心中话，

因为生命只在一瞬间。人生太短，聪明太晚(5)

记住！给活人送一朵鲜花，强过给死人送宝贵花圈，每个人生命都有尽头，许多人经常在生命即将结束时，才发觉自己还有很多事没有做，有许多话来不及说，这实在是人生最大遗憾。别让自己徒留「为时已晚」空余恨。逝者不可追，来者犹未卜，最宝贵、最需要实时掌握「当下」，往往在这二者蹉跎间，转眼错失。人生太短，聪明太晚(6)

人生短暂飘忽，包得有一首小诗这么写：高天与原地，悠悠人生路；行行向何方，转眼即长暮。正是道尽了人生如寄，转眼即逝惶恐。有许多事，在你还不知道珍惜之前已成旧事；有许多人，在你还来不及专心之前

已成旧人。

遗憾事一再发生，但过后再追悔「早知道怎样怎样」是没有用，「那时候」已经过去，你追念人也已走过了你。人生太短，聪明太晚(7)

一句瑞典格言说：「我们老得太快，却聪明得太迟。」不论你是否觉察，生命都一直在前进。人生并未售往返票，失去便永远不再得到。将希望寄予「等到方便时间才享受」人生太短，聪明太晚(8)

我们不知失去了多少可能幸福不要再等候有一天你「能够松口气」，或是「麻烦都过去了」。生命中大部分美好事物都是短暂易逝，享受它们、品尝它们，

善待你周围每一个人，别把时间浪费在等候全部难题「完满结局」上。­找回迷失生命­死亡可能是无偿─不过，却要付出生命代价。­劝大家一句话：把握当下，莫等候。成功人生十堂课

人生成功第1课

做一个终生学习人，离开学校并不意味着学习就结束了。

学习能够成为一个生活方式，帮助你发挥最大潜能。

我们从未停顿学习，总会有新，有趣东西等候我们去发觉。

学习新技能可能让人感到有一点恐惧，但每当我们在个人学习上停滞不前时，我们都需要去学习新东西。

主动地寻求支援和提议，突破停滞期。

第41页【大学课件】出品

版权归原作者全部!参加一些培训，进修，夜校－任何新兴趣都将会有利于发展你优势。

多看，多听，让你头脑保持活跃。活到老，学到老。人生成功第2课

令自己感到沮丧秘诀就是用空闲时间去烦恼自己是否高兴。所以不要费事去想它！摩拳擦掌干起来吧。你将热血沸腾，你会头脑清醒。很快，在你身体中这种高涨主动人生观将把烦恼从你头脑中赶出去。

行动起来，忙碌起来。这是世界上最廉价一个药，也是最好一个。

人生成功第3课

在困境中寻找成功希望

逆境是一所最好学校。每一次失败，每一次打击，每一次损失，都蕴育着成功萌芽，都教会我在下一次有更出众表现。我再也不会逃避现实，也不会拒绝从以往错误中获取经验，我不再所以而促成自己失败。因为我知道，宝玉不经磨砺就不能发光，没有，我也不能完善自我。

现在我知道，灵魂倍受煎熬时刻，也正是生命中最多项选择择与机会时刻。任何事情成败取决于我在寻求帮助时是抬起头还是低下头。不论何时，当我被可怕失败击倒，在最初阵痛过去之后，我都要想方设法将苦难变成好事。伟大机遇就在这一刻闪现－这苦涩根必将迎来满园芬芳！我将一直在困境中寻找成功希望。人生成功第4课

没有些人能够使你感到自卑

我选择自我感觉良好，这么我能愈加开放地学习。假如人们给我负面回应或是批评我做事情，我不会认为他们所说就表明我是一个“差劲”人。我坚信自尊由我掌控，这让我毫无戒心地去听取他人反馈，想看看是否有我能够学习东西。

我们天天都有两种选择。我们能够感到自己很棒，也能够感到自己很差劲。莫非有些人会选择后者吗？

人生成功第5课

紧紧抓住梦想

我们每个人都有梦想。我们每个人都希望能发自内心地相信自已经有一个特殊天赋，相信自己能发挥主要作用，相信自己能以一个特殊方式感动他人，相信自己能够把世界变得愈加美好。

在一生中，我们都曾经对自己渴望并追求生活品质抱有憧憬。然而，对我们大多数人来说，这些憧憬在日常生活成规和挫败中已经变得如此渺茫，以到于我们甚至不再努力去实现它们。对太多人来说，梦想已经远离，随之远离还有塑造我们命运意愿。很多人已经推进了坚定信念，而正是坚定信念为胜利者创造了优势。

我们所要做就是重拴梦想，并实现梦想，让我们每个人都记住，并去利用深藏在自己身上无限潜能。

人生成功第6课

毅力无法替换

世界上没有任何东西能够替换毅力。才能不能够，无所作为能人十分普遍；天分不能够，碌碌无为天才尽人皆知;教育不能够，受过良好教育没落者更是随地可见。只要有毅力和决心，就是无所不能。

毅力并不总是意味着永远坚持做同一件事。它意味着不论你做任何事情，你都要立刻全心投入，竭尽全力；它意味着先做艰辛工作，再去期待随之而来满足和回报。它意味着开心地工作，渴望更多知识和进步。它意味着多打几个电话，多夏装几里路，多除草，早起床，意味着总是寻求愈加好方式去做你在做事情。毅力就是经历考验和过失成功。人生成功第7课

驻足片刻闻花香

在当代生活忙忙碌碌中，人们极少会停下来观赏自然美。

问问自己，你有多少次倾听过鸟儿歌唱。你最近一次抬头仰视闪耀星空又是在什么时候？

时光飞逝，人生苦短。不要忘记驻足闻闻花香。我们在急于谋生过程中，往往忽略了我们生活品质。多少次，你听见人们为这为那说“我忙死了。”多可惜啊！有一天，当他们真找到时间能够驻足片刻闻花香时，可能已经太迟了。人生成功第8课

加入到微笑者和赞美者行列来

当你对他人，他人也会对你报以，你自然会感觉很棒。即使他有对你报以，你也会感觉很棒，因为你认识到世界上最贫穷人就是从不微笑人，当你对那个人微笑，你立刻变得愈加富有。

赞美也是这个道理。当你真诚地毛病抑或恭维一个人时，他将立刻受益，更喜欢自己。当你让他人感觉愈加好时，你自己也会感觉愈加好。

人生成功第9课让自己高兴。

调查表明，我们当中70%人在生活中时间有临床性抑郁现象。

如今我们有这么多机遇，为何我们还这么不高兴呢？

人们尝试各种东西：金钱，权利，事业，婚姻，离婚，酒精，摇滚甚至毒品，但我们大多数人只是想要得到一样东西－高兴。

高兴是人一个自然身心状态；我们只要去相信高兴，让自己感受高兴。

要宣称：我应该得到高兴。说出来，唱出来，喊出来。

优先考虑高兴，让高兴成为你最主要事情。

对你所拥有一切抱以感激之情吧。人生成功第10课我拥有没有与伦比想象力

现在我将经过这种神奇力量得到我想要。假如我害怕发演出讲，我就想象自己在公众场所无所畏惧，充满信心；假如我在病魔煎熬，我就想象我以前健康样子；假如我感到贫穷，我就想象我将要富有。

现在我明白了：人类惟一限制就是想象力。我之所以没有成功，原因就在于我不知道怎样使用我想象力。现在，我精通这个技巧，我将从中受益。最大回报将是成功和愈加高兴。你会管理时间吗?

怎样让自己一天时间不止24小时呢?这里有一些总结:你会管理时间吗?

（1）1.对目标、任务、会议等事件分别按优先级进行排序；2.从优先级最高事物着手；3.和拖延做斗争，假如事情主要，从现在开始做；4.把大、艰难任务细分为小、轻易部分；5.为自己创造一小时宁静，哪怕这需要很强意志力，或者有时不起作用；你会管理时间吗?

（2）6.找到一个隐蔽地方，如图书馆或空闲办公室；7.当你有主要事情要处理时，学会对他人说“不”；8.学会委派他人做事；9.归纳相同事情，把它们放在一起处理；10.降低例行事务：它们不值得花费过多时间。缩短低价值事件。抛开没有价值信件和文书工作。委派他人完成、降低或推迟优先级很低任务；你会管理时间吗?

（3）11.防止完美主义。记住80/20定律；12.防止做出过多许诺。对你在有限时间内能完成工作持现实态度；13.不要把时间表排得满满，为自己留下一定机动时间应付突发事件；14.设置时间限制。比如，做一些决定时，不应超出3分钟；15.聚精会神地做手头事情；你会管理时间吗?

（4）16.处理主要事情时，使用大块时间；17.快速处理困难事情，等候和拖延不会使它们变轻易；18.文书工作争取只处理一次；19.在行动以前，彻底地思索整件工作；20.第一次就做好。成功是一个习惯，习惯是需要培养

成功是一个习惯，习惯是需要培养（1）

1：找方法，不找借口。2：碰到挫折时，对自己说“太棒了”。3：不说消极话，不落入消极情绪，一旦出现马上正面处理。4：随时用零碎时间做零碎事。5：写下来，不要太依靠脑袋记忆。6：随时统计灵感。7：守时8：把主要观念方法写下来，并随时提醒自己。9：走路时，比平时快30%，肢体语言要健康，有力，不懒惰，不萎靡。10：天天自我反省一次。11：天天坚持一次运动。12：开会坐在前排。13：微笑。14：说话时，声音有力。15：说话之前，先考虑对方感受16：天天有意识或真诚地赞美他人3次17:不要用训斥指责口吻跟他人说话.18:天天做一件分外事.19:节俭.20:恪守诚信,说到做到.成功是一个习惯，习惯是需要培养（2）“好习惯让人立于不败之地，坏习惯则让人从成功宝座上跌下来”。拿破仑希尔认为，

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联络QQ：910670854保罗·盖蒂这句话很有道理。有一段时期，盖蒂抽烟抽得很凶。一天，他去法国度假途中，在一个小旅馆投宿。晚上下起了大雨，地面尤其泥泞，开了好几个钟头车之后，盖蒂实在是累极了。吃过晚饭，他就回到自己房间里，睡着了。不过清晨时分盖蒂突然醒了过来，他很想抽支烟，于是他就打开了灯，很自然伸手去摸他普通都会放在床头烟，不过没有。他下了床，到衣服口袋里去找，也没有。于是他又在行李袋里找，结果他又一次失望了。他知道这个时候旅馆酒吧和餐厅早就关门了。他想，这个时候把不耐烦门房叫过来，实在是不可能。现在他唯一能得到香烟方法就是穿好衣服，到火车站去，不过那还在6条街之外呢。成功是一个习惯，习惯是需要培养（3）看来情形并不乐观，外面还下着雨。他汽车也停在离旅馆还有一段距离车房里。而且，在他住店时候，他人也提醒过他了。车房门是午夜关，第二天早上6点才开门，现在能叫到出租车机率也相当于零。显然，要是他真迫切地需要一支烟，那么他只能在雨里走到黑暗中。抽烟欲望不停地折磨着他。于是，他下了床，脱下睡衣，穿好衣服，准备出去。正在他伸手拿雨衣时候，他突然笑了起来，笑自己傻。他突然以为，自己行为多荒谬可笑。盖蒂站在那里，心里不停地想着，一个所谓知识分子，一个商人，一个认为自己有足够智慧能够对他人下命令人，竟然在三更午夜要离开舒适旅馆，冒着大雨走上好几条街去买香烟。盖蒂也是生平第一次注意到，他现在早就养成了一个坏习惯，那就是为了一个不好习惯，他能够放弃极大舒适。看来，这个习惯对他并没有什么好处，于是，他头脑立刻就清醒了过来，很快他就做出了决定。成功是一个习惯，习惯是需要培养（4）他已经决定好了，就走到桌子旁边把那个烟盒团起来扔出去，然后重新换上睡衣，回到舒适床上。心里怀着一个解脱，甚至是一个胜利感觉，很满足地关上灯，合上了眼睛。在窗外雨声里，他进入了一个从来没有过深沉睡眠。自从那个晚上之后，他再也没抽过一根烟，也再没有想过要抽烟。盖蒂说，他并不是想用这件事来指责那些有抽烟习惯人。不过他经常回想那天晚上情形，他只是为了表示，按照他当初情况，他差点被一个恶习俘虏。经常做一件事就会形成习惯，而习惯力量是难以抗拒。不过人类还有一个潜藏缓冲能力，也不容小觑。既然人有可能养成一个习惯，那必定他也有能力改掉这种习惯。还有些人说，奇怪是，养成好习惯极难，不过一个坏习惯却在不知不觉中就已经形成了。不过，事实并非如此，这还要看一个人毅力。不论怎么说，习惯终究是习惯，并没有合理理论说坏习惯要比好习惯更轻易养成。成功是一个习惯，习惯是需要培养（5）动作灵敏或迟缓只是个时间问题，一个人要么习惯了按时，要么他就会习惯迟到。一个按时人，总会体会到这种习惯给他带来好处，不论是约会，会议，还是什么别方面承诺。假如他人请你吃饭，你迟到了，那就会给主人和其它客人造成不便。你可能会所以而变得很不受欢迎，以后人家都不会再请你吃饭了。拿破仑希尔认为，对商人来说，按时是一项尤其宝贵资产。俗话说得好，“时间就是金钱”，这句话永远是正确，现在这个时代里，这个标准比以前愈加主要。当代企业步调是一日千里，分秒必争。主管和高级职员每日安排都是满满，因为他们可没有多出时间能够浪费，就像生产线不能耽搁一样。守信对生意人来说，是个难得品德，最有希望成功商人和企业，他们一定是按时接收定单，按时回复并交货，提供服务，按时付款，按时还债。假如等时间已过去了，订货还没到，那用户下次可能就不找你了。成功是一个习惯，习惯是需要培养（6）节俭是另外一个能够养成习惯，对天生节俭人来说，这个习惯给他带来成功机会要比他人多。而习惯了节俭人，他只知道在意时就要注意节减开支和成本。受用一生教诲：职场10只魔戒N条箴言

第１只魔戒第一条箴言：习惯好像像一根缆绳，我们天天给它缠上一股新索，要不了多久，它就会变得牢不可破。第二条箴言：人类全部优点都要变成习惯才有价值，即使"爱"这么一个永恒主题，你也必须经过不停修炼，变成你习惯，才真正会化为你行动。第三条箴言：很多好观念、标准，我们"知道"是一回事，但知道了是否能"做到"是另一码事。这中间必须架起一座桥，这桥便是习惯。第四条箴言：科学家研究发觉，一个习惯养成需要２１天时间，这２１天是个平均数，但习惯一旦养成就将终生受用。第五条箴言：任何一个习惯培养都不会是轻而易举，所以一定要遵照循序渐进、由浅入深、由近及远、由渐变到突变标准。第２只魔戒第一条箴言：人生来是简单，和文明打交道之后变得复杂了，陷入了某种复杂旋涡中无法自拔，这些羁绊使人忘记人性最终追求是平静、简单、自由。

第二条箴言：不经过复杂简单是一个苍白，我曾经很人为地把金钱放在一边它却不安分，但今天当我驾驭了金钱，它就能很安分地呆在一边。第三条箴言：要锻炼一个人财商，让他含有富人心态，首先他确实要学会放弃，同时也要学会克服，要学会走出很多障碍和阴影。第四条箴言：财商教育根本目标是让人们取得自由，增加收入、降低财务问题初衷是减少人们在金钱上虚荣心和攀比风。第五条箴言：财商教育要处理人类面对金钱两大问题：恐惧与贪婪。而为了生活稳定这个假象，人们经常沦为金钱奴隶。第六条箴言：对于金钱，不是说你要成为它主人，而是要做到与之友好、平等，因为它反映是你自己，所以对它要多一分宽容。第３只魔戒第一条箴言：成功实质就是取得自由度，就是当你想当人，做你想做事，去你想去地方，说你想说话。第二条箴言：世上没有懒惰人，只有没有目标人。世界上最贫穷人就是没有目标人，因为连"梦想"都没有，还会拥有什么？第三条箴言：只有明确而详细目标才可衡量，而只有可衡量目标才可能到达。第四条箴言：付出就表示富有，索取就是贫穷，快行动起来，用行动表现你"富有"。第五条箴言：心态、目标、时间管理三者集中点就是在行动上，三者表现特征也是"行动"。它们共同形成"知行合一"统一体。第４只魔戒第一条箴言：人一生就是不停地闯进一个又一个圈子并不停争取认可过程。第二条箴言：在西方社会，尤其是在北美，只有那些树立自我推销和成功意识人，才有可能赢得机会与成功。第三条箴言：国际化人才不是一个地理意义上概念，而是文化、心理层面概念。是否是国际化人才取决于一个人涵养、知识组成和思维模式。第四条箴言：创业失败率是非常高，在美国，每年有几十万人开企业，每年也有几十万家企业倒闭，所以创业只适合一部分人。第五条箴言：我时常摸着跳动心口，数着那一下一下脉搏，计算着我生命长河终究能卷起多少浪花。我要让短暂生命，暴发出火花。第六条箴言：命运不是机遇，而是一个选择。命运从来都不是一个能够等到东西，而是一件需要去完成事情。第５只魔戒第一条箴言：不论你对成功怎样定义，主动总是有价值。主动不一定成功，但消极必定失败。第二条箴言：成功学最大特征就是强调标准化和量化，把认为说不清楚、不可琢磨东西都变成可琢磨、可操作东西。第三条箴言：成功绝对有捷径，当然它捷径绝对不是整个过程，这个捷径告诉我们是必须按照最有效成功策略去做，不然你就会越忙越犯错。第四条箴言：人改变会遵照一定轨迹，即：结果决定于行为，行为决定于态度，态度决定于信念，信念决定于自我期望。第五条箴言：人对环境有四种反应：第一是离开环境；第二是改变环境；第三是适应环境；第四是埋怨环境。前三种反应都有可能从中找到新生机，只是千万不要选择第四种反应。第六条箴言：成功秘诀第一个是坚持到底，永不放弃；第二个就是当你想放弃时候，再照着第一个秘诀去做：坚持到底，永不放弃。第６只魔戒

第一条箴言：人们总是感到自己是正确，他人和