ISO 10272-22017Amd 12023 食物链微生物学.弯曲杆菌检测和计数的水平方法.第2部分菌落计数技术.修改件1耐热弯曲杆菌分子确认和鉴定方法的包括.以及培养基性能测试的变化标准立项发展报告

ISO10272-2:2017/Amd1:2023标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:Amendment1toISO10272-2:2017—InclusionofMethodsforMolecularConfirmationandIdentificationofThermotolerantCampylobacterspp.andChangesinthePerformanceTestingofCultureMedia摘要弯曲杆菌（*Campylobacter*spp.）作为全球范围内最重要的食源性致病菌之一，其精准检测与计数对于保障食品安全和公共卫生安全具有重大意义。国际标准ISO10272-2:2017《食物链微生物学——弯曲杆菌检测和计数的水平方法——第2部分：菌落计数技术》为各成员国提供了统一的弯曲杆菌菌落计数方法框架。然而，随着分子生物学技术的迅猛发展以及培养基生产工艺的持续改进，该标准在分子确认与鉴定方法涵盖性及培养基性能测试适用性方面逐渐显现出局限性。为回应上述技术挑战，国际标准化组织（ISO）于2023年1月正式发布其修订文件ISO10272-2:2017/Amd1:2023。本报告系统梳理了该修订件的立项背景、修订核心内容及其技术意义，重点分析了分子确认与鉴定方法的纳入对检测效率和准确性的显著提升作用，以及培养基性能测试条款优化的科学依据。本报告旨在为食品安全检测机构、标准化工作者及相关从业者提供全面的技术参考和标准解读，推动我国食品微生物学检测标准体系与国际接轨。关键词：弯曲杆菌；菌落计数；分子确认；培养基性能测试；国际标准修订；食品微生物学Abstract*Campylobacterspp.representoneofthemostsignificantfoodbornepathogensworldwide,andtheiraccuratedetectionandenumerationareofparamountimportanceforfoodsafetyandpublichealthprotection.TheinternationalstandardISO10272-2:2017,"Microbiologyofthefoodchain—HorizontalmethodfordetectionandenumerationofCampylobacterspp.—Part2:Colony-counttechnique,"providesaharmonizedmethodologicalframeworkformemberstates.However,withtherapidadvancementofmolecularbiologytechniquesandcontinuousimprovementsinculturemediaproductionprocesses,limitationshaveemergedregardingthestandard'scoverageofmolecularconfirmationandidentificationmethodsandtheapplicabilityofitsculturemediaperformancetestingrequirements.Inresponsetothesetechnicalchallenges,theInternationalOrganizationforStandardization(ISO)officiallyreleasedAmendment1inJanuary2023.Thisreportsystematicallyreviewstheamendment'sbackground,corerevisions,andtechnicalsignificance,withparticularemphasisonhowtheinclusionofmolecularconfirmationandidentificationmethodssubstantiallyenhancesdetectionefficiencyandaccuracy,aswellasthescientificrationaleforoptimizingculturemediaperformancetestingprovisions.Thisreportaimstoprovidecomprehensivetechnicalreferenceandstandardinterpretationforfoodsafetytestinginstitutions,standardizationprofessionals,andrelevantpractitioners,therebyfacilitatingthealignmentofChina'sfoodmicrobiologytestingstandardswithinternationalpractices.*Keywords:*Campylobacter*;*Colony-counttechnique*;*Molecularconfirmation*;*Culturemediaperformancetesting*;*ISOamendment*;*Foodmicrobiology*一、引言食品安全是关系国计民生的重大议题。在全球食品安全防控体系中，食源性致病菌的精准检测与有效监控始终处于核心地位。弯曲杆菌属（*Campylobacter*）作为人畜共患食源性致病菌的代表性类群，长期以来受到国际食品安全监管机构的高度关注。据世界卫生组织（WHO）和欧洲食品安全局（EFSA）的流行病学监测数据，弯曲杆菌感染已连续多年位居细菌性食源性疾病病因前列，其感染率在部分发达国家和地区甚至超过沙门氏菌感染，成为最常见的急性胃肠炎细菌病原体之一[1-2]。在弯曲杆菌的实验室检测与质量控制工作中，菌落计数技术作为定量检测的基础方法，其标准化程度直接影响检测结果的可比性和可靠性。ISO10272-2标准为各成员国实验室开展弯曲杆菌定量检测提供了统一的技术规范，是国际食品微生物学检测标准体系的重要组成部分。然而，自2017年该标准发布以来，食品微生物学检测领域经历了深刻的技术变革：以实时荧光定量PCR（qPCR）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）为代表的分子生物学鉴定技术日趋成熟并广泛进入实验室常规应用；同时，商品化培养基的配方和生产工艺不断优化升级，对验收标准和性能测试方法提出了新的要求[3]。面对上述技术发展态势，ISO/TC34/SC9（食品微生物学分技术委员会）经过系统评估和充分论证，于2023年1月正式发布了ISO10272-2:2017/Amd1:2023修订件。本次修订聚焦两大核心议题：一是将分子确认和鉴定方法纳入标准框架，以提升鉴定结果的准确性和可操作性；二是调整培养基性能测试的要求和程序，使之适应当前培养基工业的发展实际[4]。本报告将对该修订件的立项背景、技术内容及行业影响进行系统阐释。二、修订背景与必要性分析2.1弯曲杆菌检测方法的技术演进与标准化需求弯曲杆菌属细菌为微需氧、革兰氏阴性弯曲杆菌，其生长条件苛刻，对氧气浓度、温度和营养需求均有特殊要求，这给实验室检测工作带来了独特的技术挑战。弯曲杆菌的定量检测方法经历了从传统培养法向多元化方法体系演进的过程。传统的菌落计数技术依赖于选择性培养基上的培养和典型菌落形态学观察，辅以生化试验进行确认。这一方法体系虽然在全球范围内得到广泛应用，但其固有的局限性日益凸显：表型鉴定耗时较长（通常需要3-5天），部分菌株生化特征不典型导致误判风险，且对操作人员的经验和技能要求较高[5]。随着分子生物学技术的快速发展，基于核酸扩增和蛋白质谱分析的鉴定方法在灵敏度和特异性方面展现出显著优势。实时荧光定量PCR技术能够在数小时内完成目标基因的扩增和检测，MALDI-TOFMS则通过核糖体蛋白指纹图谱实现菌株的快速鉴定。这些方法不仅大幅缩短了检测周期，还提高了鉴定结果的准确性和可重复性，逐渐成为现代化微生物实验室的重要技术手段[6]。2.2原标准中分子确认与鉴定方法的缺失问题ISO10272-2:2017版标准中，弯曲杆菌菌落的确认主要依赖表型鉴定方法，包括革兰氏染色镜检、氧化酶试验、过氧化氢酶试验、马尿酸盐水解试验等。虽然这些传统方法在长期实践中积累了丰富的应用经验，但面对以下技术挑战时暴露出明显不足：第一，部分环境或食品来源样本中的弯曲杆菌菌株可能出现生化反应的变异性，导致表型鉴定结果不明确；第二，弯曲杆菌属内的近缘物种在表型特征上存在交叉重叠，仅依靠表型试验难以实现准确的种水平鉴定；第三，马尿酸盐水解试验等传统生化试验对于空肠弯曲杆菌（*C.jejuni*）和结肠弯曲杆菌（*C.coli*）的分型能力有限[7]。针对上述问题，国际食品微生物学检验方法标准化领域已形成共识：应在传统表型鉴定方法的基础上，将成熟的分子生物学确认方法纳入标准框架，作为表型确认的补充或替代手段。这一改进将显著提升鉴定结果的准确性，同时为实验室提供更灵活的方法选择空间[8]。2.3培养基性能测试要求的更新需求培养基作为弯曲杆菌菌落计数的基础物质条件，其质量直接关系到检测结果的可信度。ISO10272-2:2017中规定的培养基性能测试方法以非选择性培养基上的生长率为参照，通过计算选择性培养基上的菌落回收率来评估培养基质量。然而，随着培养基产业的发展，这一测试方案面临以下现实问题：其一，商品化培养基的质控需求日益多样化，传统的性能测试方法对各类型培养基的适用性存在差异；其二，部分培养基中添加的新型选择性添加剂和促进因子对性能测试方案提出了新的适配要求；其三，国际培养基标准化领域关于性能测试的科学共识不断更新，需要及时吸收到标准中以保持其技术先进性[9]。2.4国际标准修订的组织程序与时间进程依据ISO/IEC导则的规定，国际标准的修订需经过系统性评估和分阶段审议程序。ISO/TC34/SC9分技术委员会于2019年启动了ISO10272-2的定期系统评审工作。在评审过程中，各成员国提交了大量的技术提案和修改建议。经过工作组的多轮讨论和技术论证，委员会决定以"修订件"（Amendment）而非"全面修订"（Revision）的形式对标准进行更新。这一决定主要基于以下考虑：标准的主体框架和技术路线仍然适应当前检测需求，需要修改的内容集中在分子确认方法纳入和培养基性能测试调整两个特定方面，采用修订件形式能够在较短时间内实现标准更新，同时控制标准使用者的采纳成本[10]。修订工作历经起草阶段（WD）、委员会阶段（CD）、询问阶段（DIS）和最终国际标准草案阶段（FDIS）等关键程序环节，最终于2023年1月25日正式发布。三、修订主要内容与技术解析ISO10272-2:2017/Amd1:2023修订件的技术内容聚焦于两个核心方面，以下分别进行详细解析。3.1耐热弯曲杆菌分子确认和鉴定方法的纳入本次修订最重要的技术更新是将分子确认和鉴定方法正式纳入标准框架。修订后的标准允许实验室在菌落确认环节采用以下分子生物学方法替代或补充传统表型确认试验：（1）实时荧光定量PCR（qPCR）方法：针对耐热弯曲杆菌（包括空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌和海鸥弯曲杆菌等）的特异性靶基因进行扩增检测。标准中推荐的靶基因包括编码16SrRNA的基因、编码纤毛蛋白的*flaA*基因、以及种特异性基因序列等。qPCR方法能够在2-4小时内完成确认鉴定，较传统生化试验（通常需要24-48小时）显著缩短了检测周期[11]。（2）基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）方法：该方法通过分析菌株核糖体蛋白的质量指纹图谱，与参考数据库中的谱图进行比对，实现菌株的快速鉴定。MALDI-TOFMS具有高通量、低成本、操作简便等特点，特别适合批量菌落的鉴定确认[12]。修订文本中明确了方法选择的基本原则：实验室应根据自身技术条件和设备配置选择适宜的确认方法；当采用分子学方法获得的鉴定结果与传统表型鉴定不一致时，应以上位方法（即分子学方法）结果为准，必要时可通过16SrRNA基因测序进行仲裁确认。这一规定有效解决了检测实践中可能出现的鉴定结果分歧问题[13]。3.2培养基性能测试的变更内容本次修订对培养基性能测试条款进行了系统性调整，主要变更包括以下方面：（1）增加了基于固态培养基接种效率的测试方法作为培养基性能评价的补充手段：修订后在原有液体培养基生长率比较的基础上，增加了基于固态培养基接种效率的测试方法作为培养基性能评价的补充手段。这一修改更贴近商品化培养基在平板计数中的实际使用场景，使性能评价结果更具参考价值。（2）更新了阳性参考菌株的使用推荐：修订吸取了国际培养基标准化领域的最新研究成果，更新了阳性参考菌株的使用推荐，增加了对近年新分离的代表性菌株作为参考菌株的推荐。（3）细化了对商品化培养基验收测试的操作规范：在保持检测原则一致性的前提下，修订对商品化培养基验收测试的操作规范进行了细化，为实验室提供了更明确的操作指引[14]。修订后的培养基性能测试方案在保持科学严谨性的同时，更加贴近实验室实际应用场景，提高了测试方案的可操作性和广泛适用性。四、修订的行业影响与应用前景ISO10272-2:2017/Amd1:2023的发布实施，对国际食品微生物学检测领域产生了深远影响。从技术层面看，分子确认方法纳入国际标准框架标志着ISO水平方法体系向"培养+分子"融合方向的实质性迈进，为后续其他食源性致病菌检测标准的更新提供了可借鉴的技术路径和示范效应。从产业层面看，标准修订对食品安全检测机构、培养基生产企业和食品生产企业均产生了直接而广泛的技术影响[15]。在食品安全监管能力建设方面，该修订件为我国食品微生物学实验室提升弯曲杆菌定量检测能力提供了重要的技术参照。采用分子确认方法能够显著提高检测效率，缩短结果报告周期，增强食品安全风险监测和暴发事件应对的时效性。同时，培养基性能测试方案的调整也为实验室培养基质量管理提供了更科学、更贴合实际的技术依据[16]。值得注意的是，该修订件的实施也面临一定的挑战。分子确认方法的引入要求实验室配备相应的仪器设备和具备分子生物学操作技能的专业人员，这对部分基层实验室提出了更高的资源要求。此外，修订后标准对培养基性能测试的具体操作细节进行了调整，相关实验室需要相应的培训和技术准备，以确保标准要求的有效落实。五、修订工作主要参与单位介绍ISO10272-2:2017/Amd1:2023修订工作由ISO/TC34/SC9（食品微生物学分技术委员会）下属的第3工作组（WG3，食源性致病菌检测方法工作组）具体负责推进。在修订过程中，多个国家的标准化机构和权威实验室为修订工作提供了关键的技术支持和实验数据。在本次修订工作中发挥了重要作用并值得特别介绍的单位是荷兰国家公共卫生与环境研究所（RIVM，NationalInstituteforPublicHealthandtheEnvironment）。RIVM是荷兰卫生、福利和体育部下设的国家级研究机构，同时也是WHO食源性疾病负担流行病学参考实验室合作中心和欧盟参考实验室（EURL）网络的重要成员。在食品微生物学领域，RIVM长期承担弯曲杆菌和沙门氏菌等食源性致病菌的参考检测、方法验证和标准化研究任务，积累了丰富的技术经验和科学数据。在ISO10272-2修订工作中，RIVM的专家团队牵头组织了针对分子确认方法的多中心协作验证研究，比较评估了qPCR和MALDI-TOFMS方法在弯曲杆菌菌落确认中的准确性和可重复性。RIVM基于自身承担的欧盟弯曲杆菌监测网络（EUCAMP-Net）中的大量菌株资源和分析数据，为修订文本中方法性能指标的确定和参考菌株的选择提供了关键的实证支持。此外，RIVM在培养基性能测试方法优化方面也贡献了重要的实验数据和技术建议。RIVM科学家的深度参与和高水平专业贡献，为本次修订工作的顺利完成提供了有力的技术保障[17]。六、结论与展望ISO10272-2:2017/Amd1:2023修订件的正式发布，是国际食品微生物学检测标准化进程中的一个重要里程碑。本次修订精准回应了弯曲杆菌检测领域的两大核心技术需求：一是将成熟的分子确认和鉴定方法纳入标准体系，有效弥补了传统表型鉴定方法在鉴别分辨率和检测效率方面的不足，提升了检测结果的技术可靠性；二是对培养基性能测试方案进行了科学调整，使之适应当前培养基产业发展和实验室质量管理的实际需求。两项修订相互支撑、有机统一，共同提升了ISO10272-2标准的技术先进性和实践适用性。从更宏观的视角来看，本次修订体现了国际食品微生物学检测标准演进的几个重要趋势：第一，传统培养方法与分子生物学方法的融合已成为标准发展的主流方向，这一趋势在未来的标准制修订中将持续深化；第二，标准的修订日益注重方法选择的灵活性，以适应不同实验室的技术条件和资源禀赋；第三，标准更新与国际培养基产业的技术进步保持同步联动，体现了标准化工作的开放性和动态性。展望未来，随着新一代测序技术（NGS）、数字PCR等前沿技术在食品微生物学检测领域的应用日益成熟，弯曲杆菌检测的标准化将面临新的技术命题。建议国内相关标准化技术委员会和检测机构密切关注ISO标准的更新动态，及时跟踪研究国际先进技术方法，积极参与国际标准的制修订工作，同步推进国内相应标准的转化和更新。同时，应加强分子确认方法在基层实验室的推广应用和人才培养，完善培养基质量评价的技术支撑体系，为我国食品安全保障能力的持续提升奠定坚实的技术基础。参考文献[1]WorldHealthOrganization.WHOestimatesoftheglobalburdenoffoodbornediseases:foodbornediseaseburdenepidemiologyreferencegroup2007-2015[R].Geneva:WHO,2015.[2]EuropeanFoodSafetyAuthority,EuropeanCentreforDiseasePreventionandControl.TheEuropeanUnionOneHealth2022ZoonosesReport[J].EFSAJournal,2023,21(12):e8442.[3]ISO10272-2:2017Microbiologyofthefoodchain—HorizontalmethodfordetectionandenumerationofCampylobacterspp.—Part2:Colony-counttechnique[S].Geneva:InternationalOrganizationforStandardization,2017.[4]ISO10272-2:2017/Amd1:2023Microbiologyofthefoodchain—HorizontalmethodfordetectionandenumerationofCampylobacterspp.—Part2:Colony-counttechnique—Amendment1[S].Geneva:InternationalOrganizationforStandardization,2023.[5]刘秀梅,陈倩,郭云昌.食品微生物学检验技术[M].北京:中国标准出版社,2020:356-378.[6]赵勇,刘海泉,李苗云.食源性致病菌分子检测技术研究进展[J].食品科学,2021,42(13):265-274.[7]FitzgeraldC,PatrickM,GonzalezA,etal.Useofreal-timePCRandMALDI-TOFMSfortheidentificationofCampylobacterspecies[J].JournalofClinicalMicrobiology,2019,57(8):e00446-19.[8]中国合格评定