ISO 6579-42025 食物链微生物学 沙门氏菌检测、计数和血清分型的水平方法 第4部分通过聚合酶链反应(PCR)鉴定单相鼠伤寒沙门氏菌(1,4,5,12i-)标准立项发展报告

食物链微生物学沙门氏菌检测、计数和血清分型的水平方法第4部分：通过聚合酶链反应(PCR)鉴定单相鼠伤寒沙门氏菌(1,4,[5],12:i:-)标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:Microbiologyofthefoodchain—Horizontalmethodforthedetection,enumerationandserotypingofSalmonella—Part4:IdentificationofmonophasicSalmonellaTyphimurium(1,4,[5],12:i:-)bypolymerasechainreaction(PCR)摘要随着全球化背景下食品贸易规模持续扩大，食源性病原微生物的精准检测已成为国际食品安全治理的核心议题。沙门氏菌作为引发食源性疾病最主要的病原菌之一，其变异血清型的快速识别对公共卫生防控具有重要意义。特别是单相鼠伤寒沙门氏菌（1,4,[5],12:i:-），已跃升为全球多个地区人类沙门氏菌病的主要病原体，传统血清学鉴定方法因其鞭毛抗原表达不稳定而面临显著的技术瓶颈。在此背景下，国际标准化组织（ISO）于2025年1月29日正式发布ISO6579-4:2025标准，该标准基于聚合酶链反应（PCR）技术，针对单相鼠伤寒沙门氏菌的分子特征建立了一套国际统一的鉴定方法。本报告从标准立项的背景与必要性出发，系统分析当前国际食品微生物学检测领域的标准缺口与技术需求，全面解读ISO6579-4:2025的核心技术内容、方法学特征和质量控制指标，深入比较该标准与现有国际标准、区域标准之间的技术兼容性与差异性，并详细介绍主要参与编制单位的技术贡献。报告认为，该标准的发布填补了国际食品微生物学标准体系中针对单相沙门氏菌分子鉴定的空白，对提升全球食品安全检测能力、促进国际食品贸易便利化和技术协调整合具有深远的战略意义。未来，该标准有望与高通量测序等新兴技术深度融合，持续引领食品微生物检测的标准化发展方向。关键词：沙门氏菌；单相鼠伤寒沙门氏菌；聚合酶链反应；食品微生物学；国际标准；食品安全一、引言食品安全是关乎人类健康、经济发展与社会稳定的全球性议题。世界卫生组织（WHO）数据显示，全球每年约有6亿人因食用受污染食品而患病，其中沙门氏菌感染是导致食源性疾病死亡的主要原因之一，估计每年导致约5.5万例死亡[^1]。沙门氏菌属包含超过2600种血清型，不同血清型的致病性、宿主适应性和流行病学特征存在显著差异，因此准确的血清分型对于疫情溯源、风险评估和防控策略制定具有不可替代的作用。[^1]:WHO.WHOestimatesoftheglobalburdenoffoodbornediseases[R].Geneva:WorldHealthOrganization,2015.在众多沙门氏菌血清型中，单相鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellaentericasubsp.entericaserovarTyphimuriummonophasicvariant,抗原式1,4,[5],12:i:-）近年来引起了国际食品安全领域的广泛关注。该血清型菌株在进化过程中缺失了第二相鞭毛抗原的编码基因，传统血清学鉴定方法难以将其与典型鼠伤寒沙门氏菌（抗原式1,4,[5],12:i:1,2）可靠区分。自20世纪90年代中期首次报道以来，该变异血清型在全球范围内迅速蔓延，已在欧洲、北美、南美、亚洲和大洋洲多个国家和地区成为人类沙门氏菌病的主要病原体之一[^2]。欧洲食品安全局（EFSA）的监测数据显示，在部分欧盟成员国，单相鼠伤寒沙门氏菌已跃居人类沙门氏菌分离株的首位或第二位[^3]。[^2]:SwittAIM,SoyerY,WarnickLD,etal.Emergence,distribution,andmolecularandphenotypiccharacteristicsofSalmonellaentericaserotype4,5,12:i:-[J].FoodbornePathogensandDisease,2009,6(4):407-415.[^3]:EFSA,ECDC.TheEuropeanUnionOneHealth2022ZoonosesReport[R].EFSAJournal,2023,21(12):e8442.传统表型鉴定方法面临的突出挑战在于：单相鼠伤寒沙门氏菌的第二相鞭毛抗原表达不稳定，常规血清学凝集试验可能出现假阴性或需要反复诱导培养，检测周期长、操作复杂且结果判读主观性较强。分子生物学技术的快速发展为突破这一瓶颈提供了可能。聚合酶链式反应（PCR）技术以其高灵敏度、高特异性和快速检测的优势，已在食源性病原微生物检测领域获得广泛应用，但目前国际范围内尚缺乏针对单相鼠伤寒沙门氏菌鉴定的统一标准方法。在此背景下，ISO6579-4:2025的发布具有里程碑式的意义。该标准作为ISO6579系列标准的重要组成部分，与ISO6579-1（检测方法）、ISO6579-3（血清分型方法）共同构建了覆盖沙门氏菌检测、计数和分型的完整标准体系，填补了分子生物学方法在沙门氏菌血清型鉴定方面的国际标准空白。本报告旨在全面介绍ISO6579-4:2025的立项背景、技术内容、编制过程和应用前景，为国内相关标准化工作者、食品安全检测机构和科研人员提供系统性参考。二、标准立项背景与必要性分析2.1食品安全国际治理的标准化需求在经济全球化深入发展的背景下，食品供应链的跨国界延伸使得食品安全风险呈现传导加速和影响放大的特征。国际食品法典委员会（CAC）将微生物风险评估作为食品标准制定的科学基础，而可靠的检测和鉴定方法是实施风险评估和制定食品安全管理措施的前提条件。然而，各国在沙门氏菌检测技术标准方面存在的差异，不仅增加了食品贸易的技术壁垒和检测成本，还制约了国际食品安全事件联合溯源和应对能力的提升。ISO/TC34/SC9（食品产品微生物分析方法分技术委员会）长期致力于食品微生物检测国际标准的制定与协调，其发布的系列标准被世界各国广泛采纳。2.2单相鼠伤寒沙门氏菌的流行病学挑战单相鼠伤寒沙门氏菌的全球蔓延已成为食品安全领域不可忽视的公共卫生威胁。该血清型菌株最早于1990年代中期在人类临床样本中被发现，随后在猪、牛、禽类等多种食用动物及其肉制品中被频繁检出[^4]。流行病学研究表明，该菌株与人畜共患病风险高度相关，且多表现出对多种抗生素的耐药性，包括对环丙沙星和头孢菌素类药物的耐药性呈上升趋势。近年来的分子流行病学研究进一步揭示，该变异血清型主要来源于鼠伤寒沙门氏菌基因组中第二相鞭毛抗原基因簇（fljB/fljA）区域的基因缺失或重组，这种变异不仅导致了抗原表达的缺失，还往往伴随抗生素耐药基因的共转移[^5]。[^4]:EuropeanFoodSafetyAuthority.ThecommunitysummaryreportontrendsandsourcesofzoonosesandzoonoticagentsintheEuropeanUnionin2008[J].EFSAJournal,2010,8(1):1496.[^5]:PetrovskaL,MatherAE,AbuOunM,etal.MicroevolutionofmonophasicSalmonellaTyphimuriumduringepidemic,UnitedKingdom,2005–2010[J].EmergingInfectiousDiseases,2016,22(4):617-624.传统Kauffmann-White-LeMinor（KWL）血清分型方案是沙门氏菌分型的“金标准”，但其对单相菌株的鉴定存在根本性的局限。由于第二相鞭毛抗原无法通过常规凝集试验检测到，需要经过多次诱导培养和反复试验才能确认，部分菌株甚至无法通过传统方法获得明确的血清型鉴定结果。传统方法不仅耗时（通常需要数天至数周），且高度依赖经验丰富的操作人员和完备的抗血清试剂库，不适合高通量、快速响应的现代化食品安全检测需求。2.3现有标准体系的技术缺口目前国际食品微生物学标准体系中与沙门氏菌相关的核心标准主要包括：-ISO6579-1:2017《食物链微生物学——沙门氏菌检测、计数和血清分型的水平方法——第1部分：检测沙门氏菌》该标准规定了食品和动物饲料中沙门氏菌的检测方法，但仅限于属水平的确认，不涉及血清型鉴定。-ISO6579-3:2014《食物链微生物学——沙门氏菌检测、计数和血清分型的水平方法——第3部分：使用Kauffmann-White-LeMinor方案的血清分型指南》该标准提供了基于血清学的分型方法指南，但如前所述，该方法对单相变异菌株的鉴定存在显著不足。-ISO/TS6579-2:2012关于MPN计数方法的技术规范，亦不涉及分子分型内容。可见，在ISO6579系列标准框架中，缺乏一种经过国际验证的、基于分子生物学原理的血清型特异性鉴定方法。虽然部分国家和地区已制定了针对单相鼠伤寒沙门氏菌的PCR检测方法标准或指南（如北欧国家的NMKL方法、德国的§64LFGB方法等），但这些方法在靶基因选取、反应条件和结果判读方面存在差异，不同实验室之间的检测结果可比性不足，亟需制定统一的国际标准方法。2.4技术成熟度与国际共识的形成近二十年来，PCR检测技术已从实验室研究阶段走向标准化应用阶段。实时荧光定量PCR（qPCR）技术因其闭管检测、可定量分析和污染控制良好等优势，逐步成为食源性病原微生物检测的主流方法。针对单相鼠伤寒沙门氏菌的分子鉴定，国际科学界已进行了大量基础研究和验证工作，明确了一系列具有高度特异性的分子靶标。多个国际协作研究项目（如欧盟参考实验室EURL-Salmonella组织的国际联合试验）已验证了基于PCR的鉴定方法在不同实验室间的可重复性和可再现性[^6]。这些工作为国际标准的制定奠定了坚实的技术基础和广泛的合作共识。[^6]:EuropeanUnionReferenceLaboratoryforSalmonella.IdentificationofmonophasicSalmonellaTyphimuriumbyPCR[R].Bilthoven:EURL-Salmonella,2018.综上，从公共卫生需求的紧迫性、现有标准的技术缺口、分子检测技术的成熟度以及国际社会协调一致的意愿等多个维度考量，制定一项专门针对单相鼠伤寒沙门氏菌PCR鉴定方法的国际标准，条件已经具备、需求十分迫切。三、标准主要内容与技术解读3.1标准适用范围与定位ISO6579-4:2025在ISO6579系列标准框架中承担着特定且明确的职能定位。该标准的适用对象为已通过ISO6579-1规定方法分离并初步确认为沙门氏菌的纯培养菌株。其核心功能是通过PCR技术对这些菌株进行种内鉴别，特异性识别单相鼠伤寒沙门氏菌——即具有O:4（及可能O:5）抗原，仅有第一相鞭毛抗原H:i，缺乏第二相鞭毛抗原的鼠伤寒沙门氏菌变异型菌株。需要特别指出的是，该标准并非用于食品基质中沙门氏菌的直接检测，而是定位于“鉴定”环节，即对已经分离获得的纯培养物进行确认性鉴别。这一清晰的阶段性定位，使其与ISO6579-1（检测）形成功能互补，相互衔接共同构成从样品中检出微生物到最终确定其血清型信息的完整技术链条。3.2技术原理与靶基因选择ISO6579-4:2025推荐采用实时荧光定量PCR（qPCR）方法，其技术核心在于针对单相鼠伤寒沙门氏菌基因组中特异性分子标记的选择与检测。根据国际沙门氏菌分子分型研究的最新进展和大量的基因组比较分析结果，适用于单相鼠伤寒沙门氏菌鉴定的关键分子靶标主要包括：-fljB基因缺失区域检测：单相鼠伤寒沙门氏菌的典型基因组特征之一是第二相鞭毛蛋白基因fljB及其调控基因fljA的缺失。针对该缺失区域设计特异性引物和探针，可通过检测目标序列的缺失与否来判断菌株是否为单相变异体。该检测通常采用多重PCR策略，同时扩增第一相鞭毛基因fliC（作为内参对照）和第二相鞭毛基因区域，通过扩增图谱的差异进行判定。-特异性插入/缺失标记（indels）：近年来，基于全基因组比较分析发现，部分单相鼠伤寒沙门氏菌菌株虽然缺少fljB/fljA区域，但其基因组中存在该区域邻近序列的部分保留或特征性的基因重排事件。结合对fljB/fljA区域及其侧翼序列的多位点检测，可以有效区分“真性单相”（完全缺失）和“表达沉默”菌株，提高鉴定的准确性。-管家基因内参对照：为保证PCR反应的有效性和避免假阴性结果，标准建议同时扩增沙门氏菌属特异性管家基因（如invA基因）作为内源性扩增对照。标准中对引物和探针的序列信息、退火温度、扩增循环参数等关键条件给出了明确的规定，同时要求对这些分子靶标的最低检测限（LOD）和分析灵敏度进行验证确认。3.3实验流程与操作规范ISO6579-4:2025规定的实验操作流程主要包括以下关键步骤：1.菌株培养和DNA模板制备：将待检菌株在营养琼脂培养基上划线培养，挑取单个纯化菌落，采用简便快速的DNA提取方法（如热裂解法或商业DNA提取试剂盒）制备DNA模板。标准对模板DNA的质量和浓度提出了必要的质量要求，并对可能的PCR抑制物控制进行了规定。2.PCR扩增体系配置：按照标准规定的引物/探针浓度、dNTP浓度、Mg²⁺浓度和DNA聚合酶用量配制PCR反应体系，并设置阳性对照（参考菌株，如典型单相鼠伤寒沙门氏菌株）、阴性对照（非单相沙门氏菌株，如典型鼠伤寒沙门氏菌）和无模板空白对照。3.实时PCR扩增与信号采集：在符合标准规定的实时PCR仪上执行扩增程序，在每一循环的退火/延伸阶段采集荧光信号。标准对不同品牌和型号的实时PCR仪器的适用性进行了说明。4.结果判定与解释：根据各反应孔的Ct值（循环阈值）和扩增曲线特征进行结果判定。标准明确规定了判定为“阳性”（即为单相鼠伤寒沙门氏菌）、“阴性”（非单相鼠伤寒沙门氏菌）和“无效”（需复检）的具体标准。对于Ct值处于临界区间的样本，规定了重复测试的具体方案。3.4方法性能指标与质量控制ISO6579-4:2025在方法性能验证方面做出了系统性的规定。标准明确了以下核心性能指标：诊断特异性（要求不低于99%）、诊断敏感性（要求不低于98%）、检测限、可重复性（同一实验室内不同操作者间的变异系数）和可再现性（不同实验室间的变异系数）等。这些指标的量化基准主要通过国际多中心协作验证研究的数据确定，具有充分的实证基础。质量控制方面，标准要求每批次的PCR实验都须包含完整的对照体系，包括阳性对照、阴性对照和试剂空白对照。同时，标准还推荐使用内部扩增对照（IAC）来监测PCR反应中可能存在的抑制效应。对于实验室的常规质量保证，标准还建议实验室定期参加能力验证计划，并对关键设备和试剂进行期间核查。此外，标准还针对可能出现的不确定度来源进行了分析和说明，包括DNA质量波动、PCR仪温度校准偏差、试剂批次差异、操作人员技能水平等因素，为实验室结果的质量保证提供了完整的指导。四、标准编制参与单位与组织国际标准的编制是汇聚全球顶尖专家智慧和经验的系统工程。ISO6579-4:2025由国际标准化组织食品委员会微生物方法分技术委员会（ISO/TC34/SC9）负责制定。其编制过程涉及多国标准化机构、官方检测实验室、学术研究机构和行业组织专家的深度协作。作为该标准编制的主要参与单位之一，荷兰国家公共卫生与环境研究所（RIVM）承担了重要的技术牵头和核心研究工作。RIVM是荷兰卫生、福利和体育部下属的国家级研究机构，同时也是欧盟沙门氏菌参考实验室（EURL-Salmonella）的依托单位，在全球食品微生物安全研究领域具有举足轻重的学术地位和技术影响力。在ISO6579-4:2025的编制过程中，RIVM充分发挥了其在沙门氏菌分子流行病学和标准化检测方法研究方面的深厚积累，具体贡献体现