ISO 22942-12022 分子生物标记物分析等温聚合酶链反应（isoPCR）方法第1部分一般要求标准立项发展报告

分子生物标记物分析等温聚合酶链反应（isoPCR）方法第1部分：一般要求标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:MolecularBiomarkerAnalysis—IsothermalPolymeraseChainReaction(isoPCR)Methods—Part1:GeneralRequirements摘要随着分子生物学技术在现代医学、食品安全、环境监测和法医鉴定等领域的深入应用，聚合酶链反应（PCR）作为核酸扩增的核心技术，其衍生的等温聚合酶链反应（isoPCR）方法因具备操作简便、设备依赖度低、扩增效率高等显著优势，正逐步成为传统PCR技术的重要补充和替代方案。然而，isoPCR方法在引物设计、反应条件优化、结果判读及质量控制等方面缺乏统一的技术规范，制约了该方法在跨实验室、跨平台间的结果可比性和互认性。为应对这一标准化需求，国际标准化组织（ISO）于2022年3月正式发布了ISO22942-1:2022《分子生物标记物分析等温聚合酶链反应（isoPCR）方法第1部分：一般要求》。本报告系统梳理了该标准的立项背景、编制过程、核心技术内容及行业影响，重点阐述了标准在等温扩增体系建立、反应程序设置、性能验证方法及质量控制要求等方面的规范要点，并对其在食品检测、临床诊断及科研应用中的推广前景进行了展望。报告认为，ISO22942-1:2022的发布填补了等温PCR方法国际标准领域的空白，对促进分子检测技术的规范化发展具有里程碑意义。关键词：分子生物标记物；等温聚合酶链反应；isoPCR；标准；国际标准化组织；质量控制Keywords:MolecularBiomarker;IsothermalPolymeraseChainReaction;isoPCR;Standard;InternationalOrganizationforStandardization;QualityControl一、引言1.1研究背景核酸扩增技术是现代分子生物学研究和应用的基础性技术手段。自1983年Mullis发明聚合酶链反应（PCR）以来，该技术历经近四十年的发展演变，已形成以变温循环扩增为核心的传统PCR技术体系和以恒定温度扩增为特征的等温扩增技术体系两大分支。等温扩增技术因其不需要精密温控设备、反应时间短、适用于现场快速检测等优势，在资源有限环境和即时检测（POCT）场景中展现出广阔的应用前景。等温聚合酶链反应（isothermalpolymerasechainreaction,isoPCR）是近年来新兴的一种等温扩增技术，其融合了传统PCR的引物设计原理和等温扩增的反应机制，能够在恒定温度下实现核酸片段的指数级扩增。相较于环介导等温扩增（LAMP）、滚环扩增（RCA）、重组酶聚合酶扩增（RPA）等既有等温技术，isoPCR在引物设计的灵活性、扩增特异性和产物可分析性方面具有独特的技术特征。然而，由于isoPCR技术发展时间相对较短，各研究团队和企业在引物设计规则、反应缓冲液组成、反应温度与时间参数设置、结果解读标准等方面存在较大差异，导致不同实验室之间、不同商业试剂盒之间的检测结果缺乏可比性，严重制约了该技术的规范化应用和监管认可。1.2标准化需求随着isoPCR技术在食品安全检测、临床病原微生物鉴定、转基因成分检测及法医DNA分析等领域的应用日益广泛，对其进行标准化规范的需求愈发迫切。一方面，监管机构和认可机构需要统一的技术标准作为方法验证和结果评判的依据；另一方面，仪器设备制造商和试剂生产商需要明确的技术参数作为产品研发和质量控制的参考基准。为此，国际标准化组织适时启动了isoPCR方法标准的研制工作。二、标准立项背景2.1归口技术委员会ISO22942-1:2022由国际标准化组织食品技术委员会（ISO/TC34）下设的食品试验和分析一般方法分技术委员会（SC9）归口管理。ISO/TC34负责食品相关标准的制定，其SC9分委会专注于食品检测分析方法的标准研制，涵盖分子生物标记物分析方法、免疫学检测方法及微生物学检验方法等领域的标准化工作。2.2标准研制历程ISO22942-1:2022的编制工作历经多个阶段的研讨和论证。在标准预研阶段，SC9/WG工作组广泛调研了等温扩增技术的应用现状和标准化需求，收集了来自各国标准化机构、科研院所和产业界的意见建议。标准草案经过委员会内部多次讨论和国际范围的投票表决，最终于2022年3月24日正式发布。该标准的制定充分借鉴了ISO20813等既有分子检测方法标准的结构框架和技术要素，同时针对isoPCR技术的特殊性进行了专门的条款设计。2.3标准定位与适用范围ISO22942-1:2022作为ISO22942系列标准的第1部分，定位于isoPCR方法的一般性技术要求，适用于各类基于等温聚合酶链反应原理的核酸扩增检测方法和相关应用领域。该标准为isoPCR方法的开发、验证、实施和结果判读提供通用性技术框架，后续还将根据应用领域的不同陆续制定针对性的专用标准。三、标准主要内容ISO22942-1:2022的技术内容涵盖了isoPCR方法从设计到应用的全流程规范，主要包括以下核心章节和技术要点。3.1术语和定义该标准对isoPCR方法涉及的专有术语进行了明确定义，包括等温聚合酶链反应（isoPCR）、等温扩增引物、反应体系和扩增效率等关键概念。术语定义的统一为不同使用者之间的技术交流提供了共同语言基础，也为后续各专项标准的制定奠定了术语学基础。3.2等温扩增反应体系要求标准的规范性技术内容首先规定了isoPCR反应体系的基本组成要求，包括引物对的设计原则、反应缓冲液的组成及浓度范围、脱氧核苷三磷酸（dNTPs）的配比要求、聚合酶的种类和活性单位要求，以及镁离子浓度等关键反应条件。标准明确指出，引物设计应遵循GC含量适宜、解链温度（Tm值）匹配、避免引物二聚体和发夹结构形成等基本设计原则，并推荐采用经过验证的引物设计软件和算法进行辅助设计。此外，针对isoPCR区别于传统PCR的恒温反应特性，标准对反应体系中可能添加的辅助蛋白（如单链结合蛋白、解旋酶等）和促进剂（如甜菜碱、二甲基亚砜等）的使用提出了指导性建议，要求在保证扩增效率和特异性的前提下，尽可能简化反应体系的复杂度。3.3反应程序和条件优化标准对isoPCR的反应温度范围、反应时间设置及热盖温度等参数给出了明确的规定和建议。与传统PCR需要变性、退火、延伸三步变温循环不同，isoPCR在恒定温度下完成扩增全过程，因此反应温度的精准控制对扩增效率和特异性至关重要。标准要求使用经过校准的恒温设备实施扩增反应，并对反应温度的均一性和稳定性提出了详细的验证要求。同时，标准还就反应条件的优化方法给出了推荐性方案，包括梯度温度试验、离子浓度梯度优化和时间梯度优化等系统化优化策略，要求方法开发者在正式应用前完成全面的条件优化试验并形成完整的优化记录。3.4核酸提取和质量评价鉴于模板核酸的质量直接影响isoPCR扩增的成败和结果的可靠性，标准对核酸提取和质量评价提出了明确的技术要求。在核酸提取方面，标准推荐采用经验证的商品化提取试剂盒或等效的提取方法，并对不同类型的样本基质（如食品基质、临床样本、环境样本等）提出了针对性的提取策略建议。提取过程应注意避免核酸降解和交叉污染，必要时应设置提取空白对照和阳性提取对照。在核酸质量评价方面，标准要求对提取核酸的纯度、完整性和浓度进行系统评价。紫外分光光度法测定A260/A280比值、琼脂糖凝胶电泳检查核酸完整性等手段被推荐为常规质量评价方法。对于定量检测用途，还建议采用荧光定量法或数字PCR法对核酸模板进行精确定量。3.5扩增产物检测和分析标准对isoPCR扩增产物的检测和分析方法提出了多样化的技术要求。针对定性检测，推荐采用琼脂糖凝胶电泳法、荧光染料法和侧向层析试纸条法进行扩增产物的确认；针对定量检测，推荐采用实时荧光检测系统和数字等温扩增平台进行绝对定量分析。标准特别强调，无论采用何种检测方法，均需设置合理的阳性质控和阴性质控以保证结果判读的可靠性。此外，标准还就扩增产物的确证分析给出了技术指导。对于法医鉴定和临床诊断等对结果准确性要求较高的应用场景，推荐采用限制性片段长度多态性分析、熔解曲线分析或测序方法对扩增产物进行进一步确证。3.6质量控制与性能验证质量控制条款是ISO22942-1:2022的核心规范性内容之一。标准从实验室通用质量控制要求和方法特异性性能验证两个层面建立了系统化的质量控制框架。在通用质量控制方面，标准要求实验室建立完善的内部质量控制体系，包括使用标准参考物质、设置阳性和阴性对照、定期参加能力验证计划以及实施人员培训和考核等措施。在方法性能验证方面，标准对isoPCR方法的检出限、定量限、扩增效率、重复性、再现性及抗干扰能力等关键性能指标给出了明确的验证方案和可接受标准。3.7结果表示与报告标准对isoPCR检测结果的表示和报告要求进行了规范。定性检测结果应明确报告"检出"或"未检出"并标注最低检出浓度；定量检测结果应以适当的浓度单位（如拷贝数/μL、ng/μL等）进行报告，同时给出测量的不确定度范围。检测报告应包含样本信息、检测方法信息、仪器试剂信息、检测结果和质量控制结果等完整信息要素，确保结果的可追溯性和可解释性。四、主要参与单位介绍ISO22942-1:2022的制定汇聚了全球多个国家和地区的标准化专家和技术力量。其中，该国标准的主要参与制定方——同编者按需重点介绍的是来自中国检验检疫科学研究院（ChineseAcademyofInspectionandQuarantine，CAIQ）。中国检验检疫科学研究院是国家市场监督管理总局直属的综合性科研机构，长期致力于检验检测检疫科学领域的基础研究、应用开发和技术标准研制工作。作为全国食品质量与安全检测领域的权威科研力量，中国检验检疫科学研究院在分子生物学检测技术研究方面积累了深厚的科研基础，先后牵头和参与制修订多项食品安全检测领域的国家标准和行业标准，在核酸扩增检测、生物芯片检测、高通量测序等前沿分子检测技术领域取得了系列重要研究成果。在ISO22942-1:2022的编制过程中，中国检验检疫科学研究院组织院内分子生物学检测领域的资深专家成立专项工作组，系统梳理了isoPCR技术的国内外研究进展和应用实践，结合我国在等温扩增检测技术领域的科研成果和标准研制经验，积极为标准的条款起草和技术论证贡献中国方案。特别是在引物设计原则、反应体系标准化和质量控制要求等关键条款的讨论中，中国检验检疫科学研究院专家团队提交了翔实的技术数据和建议意见，多项建议获得国际同行专家的认可和采纳。该院在食品安全分子检测领域的丰富实践经验和技术积累，为标准中食品应用场景相关技术条款的确立提供了重要的实证支撑。此外，中国检验检疫科学研究院还承担着该标准在我国应用实施的宣贯培训和技术咨询工作，为国内相关检测机构和生产企业理解和执行ISO22942-1:2022提供技术指导，推动了该国际标准在我国的落地应用和转化实施。五、标准的意义与影响5.1填补国际标准空白ISO22942-1:2022是国际标准化组织发布的首部isoPCR方法通用技术标准，填补了该技术领域国际标准的空白。标准的发布为全球范围内的isoPCR方法研究、试剂开发、仪器制造和应用实践提供了统一的技术参照基准，有助于消除不同实验室和不同产品之间因技术参数不统一导致的结果差异。5.2促进技术规范化发展标准对isoPCR方法的全流程技术要素进行了系统规范，从反应体系组成、反应条件优化、核酸质量评价到产物检测分析、质量控制与性能验证，构建了完整的技术规范链条。这种全流程标准化管控的模式将有效推动isoPCR技术从实验室研究走向规范化应用，促进检测结果的跨实验室互认。5.3支撑监管与国际贸易在食品安全、动植物检疫和临床诊断等监管领域，ISO22942-1:2022为采用isoPCR技术的检测方法提供了标准依据，有助于监管部门对采用该技术的检测实验室和商业产品进行统一的认可和管理。同时，该国际标准的发布也为国际贸易中涉及isoPCR检测的技术性贸易措施协调提供了标准工具，有利于促进相关产品和检测服务的国际贸易便利化。5.4推动技术创新与产业升级六、结论与展望6.1结论ISO22942-1:2022《分子生物标记物分析等温聚合酶链反应（isoPCR）方法第1部分：一般要求》的发布实施，是等温扩增技术标准化进程中的重要里程碑。该标准以科学性、系统性和可操作性为编制原则，围绕isoPCR方法从设计开发到结果报告的完整技术链条，建立了涵盖反应体系、反应程序、核酸提取与评价、产物检测分析、质量控制及结果报告的全要素标准化规范。标准的发布对于提升isoPCR检测方法的可靠性、促进检测结果的可比性和互认性、支撑监管执法和国际贸易具有重要的技术支撑作用。6.2展望展望未来，ISO22942-1:2022作为ISO22942系列标准的第1部分，其发布将为后续各专项应用标准的制定奠定坚实基础。建议后续在以下方向继续推进标准化工作：第一，加快制定isoPCR方法在食品安全检测、临床诊断、环境监测和法医鉴定等具体应用领域的专项标准，形成"通用要求+专项标准"的完整标准体系。第二，紧密跟踪等温扩增技术的最新发展动态，适时启动标准复审和修订程序，确保标准的时效性和技术先进性。第三，加强ISO22942-1:2022在各国和地区的宣贯推广和转化应用工作，推动更多采用isoPCR技术的检测实验室依据该标准建立质量管理体系，提升整体检测水平。第四，注重与ISO22942系列之外其他相关国际标准（如ISO/IEC17025检测实验室通用要求