CN119452091A 从发酵液中回收和纯化聚羟基烷酸酯的方法 （维尔萨利斯股份公司）

2024.12.26PCT/IB2023/0565682023.06.26WO2024/003698EN2024.01.04从发酵液中回收和纯化聚羟基烷酸酯的方法从源自微生物发酵的发酵液中回收和纯化聚羟基烷酸酯(PHA)的方法，其包括以下步骤：(a)在至少一种酸的存在下对发酵液本身进行热或储存后进行分离，获得包含聚羟基烷酸酯(PHA)的细胞生物质的水悬浮液和包含发酵残余烷酸酯(PHA)的细胞生物质的水悬浮液进行提优选在等于60℃的温度下进行5分钟至30分钟，优选8分钟至20分钟的时间，更优选等于10分钟的时间。上述聚羟基烷酸酯(PHA)可有利地用于2(c)对步骤(b)中所获得的包含聚羟基烷酸酯(PHA)的细胞生物质的水悬浮液进行提2.根据权利要求1所述的从源自微生物发酵的发酵液中回收聚羟基烷酸酯(PHA)的方3.根据权利要求1或2所述的从源自微生物发酵的发酵液中回收聚羟基烷酸酯(PHA)的4.根据前述权利要求中任一项所述的从源自微生物发酵的发酵液中回收聚羟基烷酸5.根据前述权利要求中任一项所述的从源自微生物发酵的发酵液中回收聚羟基烷酸6.根据权利要求5所述的从源自微生物发酵的发酵液中回收聚羟基烷酸酯(PHA)的方7.根据前述权利要求中任一项所述的从源自微生物发酵的发酵液中回收聚羟基烷酸酯(PHA)的方法，其中在进行提取、纯化和干燥的步骤(c)之前，所述包含聚羟基烷酸酯(PHA)的细胞生物质的水悬浮液通过用脱矿质水或含有微量细胞碎片的稀释的水溶液稀释8.根据权利要求7所述的从源自微生物发酵的发酵液中回收聚羟基烷酸酯(PHA)的方优选250g/l(干重)至500g/l(干9.根据前述权利要求中任一项所述的从源自微生物发酵的发酵液中回收聚羟基烷酸得的所述包含聚羟基烷酸酯(PHA)的细胞生物质的水悬浮液进行机械细胞裂解和/或化学10.根据权利要求9所述的从源自微生物发酵的发酵液中回收聚羟基烷酸酯(PHA)的方3法，其中通过机械处理将所述包含聚羟基烷酸酯(PHA)的细胞生物质的水悬浮液进行细胞11.根据权利要求10所述的从源自微生物发酵的发酵液中回收聚羟基烷酸酯(PHA)的12.根据权利要求11所述的从源自微生物发酵的发酵液中回收聚羟基烷酸酯(PHA)的13.根据权利要求11或12所述的从源自微生物发酵的发酵液中回收聚羟基烷酸酯的包含聚羟基烷酸酯(PHA)的水悬浮液进行第一浓缩步骤，第一浓缩步骤优选通过连续离心进行，随后通过用脱矿质水或含有微量细胞碎片的稀释的水溶液稀释来进行洗涤步骤，随后通过分批或连续进行的切向过滤和/或离心进行第二浓缩步骤，第二浓缩步骤优选通14.根据权利要求13所述的从源自微生物发酵的发酵液中回收聚羟基烷酸酯(PHA)的15.根据权利要求11至14中任一项所述的从源自微生物发酵的发酵液中回收聚羟基烷水分小于0.5％的包含聚羟基烷酸酯(PHA)的固体16.根据权利要求1至8中任一项所述的从源自微生物发酵的发酵液中回收聚羟基烷酸获得的所述包含聚羟基烷酸酯(PHA)的细胞生物质的水悬浮液进行17.根据权利要求16所述的从源自微生物发酵的发酵液中回收聚羟基烷酸酯(PHA)的4在30℃至60℃,优选50℃的温度下，用乙醇对包含聚羟基烷酸酯(PHA)的脱水细胞粉并在室温(25℃)下将留在过滤器上的包含聚羟基烷酸酯(PHA)的固体残余物进行干燥大于一将溶解后所获得的包含聚羟基烷酸酯(PHA)的溶液用隔膜过滤器或用纤维素过滤器0.5bar的压力下操作来浓缩所获得的所述包含聚羟5[0002]更具体地，本发明涉及从源自微生物发酵的发酵液中回收和纯化聚羟基烷酸酯质的水悬浮液和包含发酵残余物的水相；(c)对步骤(b)中所获得的包含聚羟基烷酸酯[0004]聚羟基烷酸酯(PHA)是羟基烷酸酯(例如3一羟基丁酸酯(3HB)、3一羟基戊酸酯以积累高达细胞质量(cellmass)的80重量然后必须通过以获得足够纯度的聚羟基烷[0005]与合成聚合物和从可再生资源中所使它们成为作为石化来源的聚合物的可生物降解替代品的特别基烷酸酯(PHA)的回收和纯化必须以具有最大可能效率的方式进行，而不影响所生产的聚羟基烷酸酯(PHA)的相同微生物(如果它们处于不利的生长条件下)能够激活导致所生产的生物合成途径生产的不同类型的聚羟基烷酸酯(PHA)。众所周知，所生产的聚羟基烷酸酯6(PHA)的提取过程对决定它们的最终性质(在结晶度方面和纯度方面)起着至关重要的作andMixedMicrobialCultures:AReview”,“FrontiersinBioengineeringand[0013]所获得的聚羟基烷酸酯(PHA)的质量，通常通过凝胶渗透色谱分析(GPC)测定聚羟基烷酸酯(PHA)的分子量和多分散指物和/或无机化合物)和包含聚羟基烷酸酯(PHA)的细胞生物质的所述发酵液经历分离阶释进行洗涤，获得包含聚羟基烷酸酯(PHA)的细胞生物质的水悬浮液和包含发酵残余物的[0015]将上述水相作为水流除去，同时将上述包含聚羟基烷酸酯(PHA)的细胞生物质的水悬浮液进行提取，该提取可以在没有溶剂的情况下通过机械细胞裂解和/或化学细胞裂羟基烷酸酯(PHA)的所述水悬浮液再次通过分离和例如用脱矿质水稀释(如上所述)进行的[0020]文献中已知在所述分离和洗涤阶段以及所述提取阶段之间插入中间预处理阶段7是如何可能且有用的，中间预处理阶段的目的 [(R)_3_hydroxyalkanoates](PHA)biopolyestersfromsurroundingbiomass”,骤之前通过冷冻干燥或通过热处理(例如，通过用热空气干燥)来干燥包含聚羟基烷酸酯 械细胞裂解的可能性，其中将包含聚羟基烷酸酯(PHA)的细胞生物质的水悬浮液引入均质[0022]Pérez_RiveroC.等人在“ASustainableApproachfortheDownstreamProcessingofBacterialpolyhydroxyalkanoates:State_of_the_artandlatest[0024]JiangY.等人在“Feasibilitystudyofanalkaline_basedchemicaltreatmentforthepurificationofpolyhydroxybutyrateproducedbyamixed[0025]YuJ.等人，在“GenerationandUtilizationofMicrobialBiomassHydrolysatesinRecoveryandProductionofPoly(3_hydroxybutyrate)”,/10.5772/52940中，报道了一种从发酵液中提取聚_3_羟基丁酸酯 [0026]专利US9,683,076涉及从细胞培养物中回收和纯化聚羟基烷酸酯(PHA)的方法，8截留物(retentate)的浓缩PHA悬浮液和作为第一渗透物的[0034]专利EP1,705,250涉及一种从源自细菌发酵液的细胞中直接分离和纯化聚羟基[0042]专利US7,393,668涉及一种从含有聚羟基烷酸酯的微生物细胞中回收聚羟基烷[0043](a)包括在搅拌时向含聚羟基烷酸酯的微生物细胞的水悬浮液中加入碱，并进行[0044](b)包括用酶和/或表面活性剂处理分离的聚羟基烷酸酯以溶解粘附在聚羟基烷[0045]以上报道的现有技术描述了回收和纯化聚羟基烷酸酯(PHA)的方法，但是没有集中于包括发酵液本身的稳定化步骤及其与随后的提取和纯化步骤的可能结合的方法的开烷酸酯(PHA)的解聚过程是细胞内类型的，并且包括在发酵过程中积累在微生物的细胞内如KnollM.等人在“ThePHADepolymeraseEngineeringDatabase:Asystematicanalysistoolforthediversefamilyofpolyhydroxyalkanoate(PHA)9于所用微生物的细胞的残余活性或者也由于迅速抑制能够改变微生物的细胞中存在的聚羟基烷酸酯(PHA)的质量和数量的任何代谢过[0047]上述稳定化阶段在发酵液的处理的第一步由费力或复杂的操作组成的情况下是[0048]已知技术中的另一个常见问题是进行化学裂解和/或机械裂解的发酵液中微生物[0050]申请人现已发现，从源自微生物发酵的发酵液中回收聚羟基烷酸酯(PHA)可以有(b)将步骤(a)中所获得的发酵液直接分离或储存后进行分离，获得包含聚羟基烷酸酯(PHA)的细胞生物质的水悬浮液和包含发酵残余物的水相；(c)对步骤(b)中所获得的包含目标可有利地应用于在存在溶剂的情况下的提取过程和在不存在溶剂的情况下的提取过[0051]因此，本发明的目的是从源自微生物发酵的发酵液中回收聚羟基烷酸酯(PHA)的酸酯(PHA)的细胞生物质的水悬浮液和包含发酵残余物的水[0054](c)对步骤(b)中所获得的包含聚羟基烷酸酯(PHA)的细胞生物质的水悬浮液进行[0058]可用于本发明的目的的发酵液可以来源于任何能够生产聚羟基烷酸酯(PHA)，特(Cupriavidus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、盐单胞菌属(Halomonas)、产碱菌属(Alcaligenes)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、固氮菌属(Azotobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、诺卡氏菌属直接或储存后进行切向过滤和/或离心，其可以分批或连续进行，更优选通过连续离心进[0067]根据本发明的优选实施方案，所述包含聚羟基烷酸酯(PHA)的细胞生物质的水悬[0069]所获得的包含聚羟基烷酸酯(PHA)的细胞生物质的水悬浮液的细胞浓度可以通过生物的细胞的重量，其通过在WhatmanGFfilters/F(0.7μm)上过滤除在105℃的通风烘箱中热处理至恒重(约24小时)后称重上述微生物的细胞来确定。[0070]对分离步骤(b)中所获得的包含聚羟基烷酸酯(PHA)的细胞生物质的水悬浮液进[0071]本发明的方法目的的提取、纯化和干燥的步骤(c)可以在存在或不存在溶剂的情离(b)中所获得的包含聚羟基烷酸酯(PHA)的细胞生物质的水悬浮液可以进行机械细胞裂[0073]根据本发明的优选实施方案，所述包含聚羟基烷酸酯(PHA)的细胞生物质的水悬浮液可以通过机械处理进行细胞裂解，这可以使用高压均质机(例如，Gea的均质机得避免聚羟基烷酸酯(PHA)可能降解的温度和压力[0076]向所述包含聚羟基烷酸酯(PHA)的碱化的水悬浮液中加入至少一种表面活性剂，其量为基于每克所述包含聚羟基烷酸酯(PHA)的水悬浮液干重的0.05至1g，优选0.1至[0077]根据本发明的优选实施方案，所述化学细[0080]适用于本发明目的的阳离子表面活性剂可以选自例如烷基三甲基铵或二烷基二[0081]适用于本发明的目的的非离子表面活性剂可选自例如以下：聚氧化烯(优选聚氧[0082]根据本发明的优选实施方案，从化学细胞裂解中所获得的包含聚羟基烷酸酯(PHA)的水悬浮液可以通过切向过滤和/或离心进行第一步浓缩，其可以分批或连续进行，来进行洗涤阶段，随后通过切向过滤和/或离心进行第二浓缩步骤，其可以分批或连续进羟基烷酸酯(PHA)的水悬浮液中所含有的所述有机物质和所述聚羟基烷酸酯(PHA)的重量，其通过在WhatmanGF/F过滤器(0.7μm)上过滤除去所有水分后称重所述有机物质和聚羟基烷酸酯(PHA)并随后在105℃的通风烘箱中热处理直到恒重(约24小时)来确定。[0085]根据本发明的优选实施方案，从化学细胞裂解所获得的包含聚羟基烷酸酯(PHA)的水悬浮液可以进行干燥，优选在通风烘箱中，在大于或等于50℃,优选55℃至70℃的温骤(b)中所获得的包含聚羟基烷酸酯(PHA)的细胞生物质的水悬浮液可以进行冷冻和冷冻[0088]将所述包含聚羟基烷酸酯(PHA)的细胞生物质的水悬浮液在20℃时冷冻，随后[0089]在30℃至60℃,优选50℃的温度下，用乙醇将包含聚羟基烷酸酯(PHA)的脱水细[0090]用多孔隔膜过滤器或纤维素过滤器过滤所获得的包含聚羟基烷酸酯(PHA)的悬浮液，并在室温(25℃)时将留在过滤器上的包含聚羟基烷酸酯(PHA)的固体残余物进行干残余物在40℃至70℃,优选60℃的温度下，在干燥的残余[0092]用隔膜过滤器或用纤维素过滤器将溶解后所获得的包含聚羟基烷酸酯(PHA)的等于0.5bar的压力下操作来浓缩所获得的包含聚羟基烷酸3[0099]聚羟基烷酸酯(PHA)可以是均聚物和共聚物或三元共聚物。在共聚物或三元共聚物的情况下，它们可以由具有通式(I)的不同重复单元与至少一种源自能够与羟基烷酸酯在存在至少一种碱和至少一种表面活性剂的情况下)。将在细胞化学裂解结束时所获得的包含干燥的聚羟基烷酸酯(PHA)的固体残余物在存在至少一种溶剂(例如，氯仿)的情况下烷酸酯(PHA)的固体残余物(图2中未示出)和包含聚羟基烷酸酯(PHA)的溶液(图2中未示[0109]将2升所获得的发酵液置于5升的烧杯中，并在以使得pH达到等于5的值的量加入水悬浮液以达到250g/l(干重)的细[0111]通过均质机(Gea的Mod.PandaPLUS2000)中的通道将所获得的稀释的细胞生物质(颗粒)的水悬浮液在1000bar和室温(25℃)下进行机械裂解，随后通过加入脱矿质水进行p[0119]聚苯乙烯(PS)标准试剂盒[峰值分子量(M)为580g/mol至6570000g/mol的10种p[0121]整个过程的提取产率表示如下：发现在过程结束时所获得的聚一3一羟基丁酸酯℃并在所述温度以及在搅拌(250rpm)下保持10分钟。随后，通过让温度自然降至室温(25脱矿质水将所获得的细胞生物质(颗粒)的水悬浮液稀释至初始细胞浓度(即150g/l)(干固体残余物在室温(25℃)干燥24小时。[0127]随后，在等于60℃的温度时，将干燥的固体残余物在氯仿(纯度≥99.8％一HiPerSolvCHROMANORM8一VWR)(干燥的固体残余物:氯仿的比率等于1:200)中溶解[0131]整个过程的提取产率表示如下：发现在过程结束时所获得的聚一3一羟基丁酸酯[0137]评估所进行的两次热重分析(TGA)的结果的差异，第一次是在细胞液(cellularbroth)从发酵设备中排出后立即进行的，第二次是在发酵后5小时开始进行的离心后所回[0141]将2升所获得的发酵液置于5升烧杯中，并97％硫酸(EMSURE®ISO一Merck)制备)(其量使得pH值等于5)后，将整体加热至60℃,并(25℃)。在室温(25℃)储存20小时后，将发酵液在固定转子实验室离心机中进行离心释至初始细胞浓度(即150g/l)(干重)，并在固定转子实验室离心机中再次进行离心体残余物在室温(25℃)干燥24小时。[0143]随后，在等于60℃的温度时，将干燥的固体残余物在氯仿(纯度≥99.8％一HiPerSolvCHROM