CN119452127A 用于使丝纤维脱胶的方法 （耶达研究与发展有限公司）

2024.12.11PCT/IL2023/0506232023.06.15WO2023/242849EN2023.12.21确且精确地确定生物纤维诸如丝纤维的力学性2,5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述孵育介质还包含至少一种缓冲9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，还12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，还包括将所述丝纤维分离成单独的纤14.根据权利要求13所述的脱胶的丝纤维，其中所述纤维呈现出至少10GPa的杨氏模15.根据权利要求13所述的脱胶的丝纤维，其中所述纤维呈现出是未经处理的丝纤维16.根据权利要求13所述的脱胶的丝纤维，其中所述纤维呈现出至少400MPa的拉伸强17.根据权利要求13所述的脱胶的丝纤维，其中所述纤维呈现出是未经处理的丝纤维19.根据权利要求13所述的脱胶的丝纤维，其中所述纤维呈现出至少400MPa的威布尔20.根据权利要求13所述的脱胶的丝纤维，其中所述纤维呈现出是未经处理的丝纤维21.根据权利要求13所述的脱胶的丝纤维，其22.根据权利要求13所述的脱胶的丝纤维，其中所述3a.使用共聚焦显微镜沿着所述不对称纤维中的一根不对称纤维的长度获得多于一个h.计算所述多于一根不对称纤维的平均最大强a.将所述多于一个应力/应变数据集的最大强度从最低到最高排序，并为所述数据集32.根据权利要求27至31中任一项所述的方法，其中所述不对称纤维包覆有另外的材4[0001]本发明涉及一种用于使丝纤维脱胶以及用于获得高品质的丝素蛋白(silk和/或再加工成许多不同的材料形式。确定丝素蛋白纤维的特殊力学的标准方法涉及经由在含有Na2CO3的水溶液中煮沸纤维来去除称为丝胶蛋白(sericin)的胶包覆层(gum的方法对于保护蛋白质(丝素蛋白(fibroin[0005]在一种实施方案中，本发明涉及开发用于丝胶蛋白胶层的非热节约去除(non_25[0011]在一种实施方案中，脱胶的丝纤[0014]a)使用共聚焦显微镜沿着不对称纤维中的一根不对称纤维的长度获得多于一个[0024]a)将多于一个应力/应变数据集的最大强度从最低到最高排序，并为数据集分配6[0033]图1E至图1I示出了通过使用不同脱胶方法获得的脱胶的RSF纤维的显微镜分析。[0034]图2示出了对所产生的丝和脱胶的丝素蛋白纤维的力学行为的分析。图2A表示横[0038]图6图示出了未经处理的纤维、经由标准方法脱胶的纤维和用基于NaOH的溶液处理的丝素蛋白纤维的测量的横截面面积的协同[0042]图10示出了在不同脱胶处理之前和之后纤维的TGA分析。对脱胶的丝素蛋白纤维[0043]图11示出了与可溶性丝素蛋白的结构特性和机理相关的性质。图11A示出了可溶度(azimuthally_interactedbackground_subtractedsolutionX_rayscatteringabsoluteintensity)I作为天然丝和从不同脱胶方法获得的可溶性RSF的散射矢量q的大情况下脱胶的丝纤维的化学再溶解获得的RSF溶液。阴影的颜色代表标准偏差(平均值±7[0046]图14示出了脱胶的丝纤维和未经处理的丝纤维的傅立叶变换红外光谱(FTIR)分示出了在1610cm_1_1635cm_1处的β_片层(β_sheet)、在1690cm_1_1705cm_1处的反平行β_片_1_1665cm_1处的无规卷曲和α_螺旋以及在1665cm_1_1690cm_1处的β_转角的相丝胶蛋白胶包覆层之间进行分离形式的预处理。丝胶蛋白层的分数在总纤维重量的25％_的分数定义了最终纤维的强度。丝纤维的整体力原料)内的可溶性丝素蛋白从相对无序的状态这样的程序通常通过改变丝素蛋白组分的折叠或通过在重链蛋白质亚基和轻链蛋白质亚8维和煮沸的纤维相比，用开发的制剂去除丝胶蛋白层分别改善了纤维的杨氏模量(96％和纤维和在标准含Na2CO3溶液中煮沸的煮沸纤维相比，本公开内容的丝纤维处理保留丝素蛋[0053]丝素蛋白纤维代表一类蛋白质构件，其可以被进一步功能化和/或再加工成不同材料形式。确定这些纤维的特殊力学的标准方法涉及在存在Na2CO3的情况下经由煮沸纤维来去除丝胶蛋白胶包覆层，并且经由应用完美圆柱体的形状近似来进一步分析和计算力这是生物纤维中的常见现象。本文公开了用于丝胶蛋白胶层的非热节约去除的制剂，其保留丝素蛋白的完整性、其二级结构并因此改善纤维力学和纤维稳定性。该方法已经得到证实，并且能够获得高纯度且流变特性与最初储存在动物丝腺中的天然丝原料的流变特性相维的不对称性和多种缺陷的存在。所开发的方法不仅有益于产生具有定制性质的基于丝的9少一部分。实施方案中，使用脚本以从共聚焦显微镜分析中提取非均匀纤维的体积参数和横截面参艺还包括染色程序以能够实现生物聚合物复合材料组分之间的区分。在一种实施方案中，胶的标准方案造成的热损伤。目前使用的标准方案涉及在100℃在水性碳酸氢钠(Na2CO3，胶去除的介质的详细筛选(对于液体溶液0.1M至1M的不同摩尔浓度值的NaOH的情况下的短时间孵育导致丝胶蛋白去除的高收率(参些实施方案中，冲洗/洗涤可以包括在水流下洗涤脱胶的纤维或以其他方式将脱胶的纤维可以使用针对期望的pH和离子强度优化的任何溶液组合物进行渗析，所述溶液组合物例[0065]在脱胶的丝纤维在水/溶液中冲洗/洗涤之后，可以通过干燥来获得脱胶的纤[0068]在一些实施方案中，丝纤维在存在氢氧化物(例如氢氧化钠(NaOH))的情况下孵2[0071]在一些实施方案中，丝胶蛋白层或胶层构成脱胶的丝纤维的横截面面积和/或体积的0％至20％。在一些实施方案中，丝胶蛋白层或胶层构成脱胶的丝纤维的横截面面积量的0％至10％。在一些实施方案中，丝胶蛋白层或胶层构成脱胶的丝纤维的材料质量的一些实施方案中，丝胶蛋白层或胶层构成脱胶的丝纤维的材料质量的小于0.1％、或小于制本发明的范围。[0083]图1A描绘了丝纤维的扫描电子显微镜图像。图1B描绘了纤维的共聚焦显微镜成激发和在434nm处测量的发射)用于测量包含丝素蛋白组分和丝胶蛋白组分两者的不对称材料的消光系数的变化而改变其荧光)仅用于丝素蛋白组分的选择性染色。尼罗红染料发的固有发射与仅来自丝素蛋白组分的尼罗红白和丝胶蛋白)之间产生精确的光学区分。这样的区分有助于计算纤维及其任何组分的横[0089]丝素蛋白组分和丝胶蛋白组分是可以用于本发明的实施方案的多种纤维组分中[0090]由于丝纤维的不对称形状和不均匀性，在丝力学的计算中通常不使用体积参学计算。横截面分析示出了通过标准Na2CO3脱胶工艺处理的纤维的不一致性和大的标准偏[0091]未经处理的纤维、经由标准方法(Na2CO3)脱胶的纤维和用基于[0092]根据需要在处理之前或之后进行丝素蛋白以及丝素蛋白和丝胶蛋白的横截面面2[0102]a)使用共聚焦显微镜沿着不对称纤维中的一根不对称纤维的长度获得多于一个[0114]a)将多于一个应力/应变数据集的最大强度从最低到最高排序，并为数据集分配聚焦显微镜沿着不对称纤维中的一根不对称纤维的长一种实施方案中，脱胶的丝纤维表现出至少550MPa的拉伸强度。在一些实施方案中，术语用。[0128]在一种实施方案中，脱胶的丝纤维呈[0129]在一种实施方案中，脱胶的丝纤维一些实施方案中，如本文所描述的本发明的方法适用于具有小于1μm或大于50μm的厚度的围一个或更多个丝素蛋白区段(fibroinsegment(s))并且也存在于两个丝素蛋白区段之[0139]如本文提及的，“孵育介质(incubatingmedium)”、“孵育介质(incubation制本发明的范围。配置和测试样本大小的分布表示纤维的平均强度[0152]拉伸应力‑应变曲线示出了所有纤维的初始和简明(concise)的弹性响应(～1%‑[0153]表2是制成表的对于未经处理的丝纤维和对于使用标准方法例如Na2CO3处理方法维的初始实际横截面面积(图2A)引入到力学计算中对于获得对这些纤维的力学性能的准[0158]表2示出了未经处理的丝纤维和通过使用标准方法以及开发的处理方法脱胶的丝纤维暴露出应变硬化性能以及随着它们逐渐失[0163]先前已经在蜘蛛丝和柞蚕(A.pernyi)丝根丝纤维中相邻丝素蛋白纤维独立地抵抗不同应变的能力可以对整个纤维的韧性具有积[0167]用NaOH0.1M和NaOH0.5M对家蚕丝脱胶产生如图2E和表2中示出的分别为~[0173]图2F中的斜率指示强度分布宽度。图2F的曲线中的蠕动通常出现在小样品群体胶处理通过其更低的β值示出更宽的强度分布(表2)。对于表2中的每个样品示出的特征强(图2F)。在这种积极的脱胶工艺之后也观察[0175]在分别用NaOH0.1M和NaOH0.5M使丝脱胶之后丝素蛋白的断裂应变与呈其天然[0176]脱胶处理的差异，特别是与没有热损伤的基于NaOH的脱胶相比于使纤维的热稳定性只有小的差异(参见图3和图9以及存在NaOH的情况下脱胶的样品记录的TGA数据在STD±~1.94℃的情况下是高度可再现的。的情况下脱胶的样品记录的TGA数据在STD<～6％的情况下规卷曲丝蛋白的丝I结构。2.5A、3.06A、3.5A、5.2A和6.3A的衍射峰不存在于Na2CO3处理亚基的丢失/崩解。丝素蛋白是包含重链和轻链的两个蛋白质亚基的大的球状蛋白质(~基乙醇(一种在电泳凝胶分析中使用的化学组分)能够是响应于所施加的剪切的粘度变化的流变学分响应于施加的剪切的粘度变化，其中剪切速率从0.1s_1增加至500s_1并从500s_1降低回到_1中提取的天然丝素蛋白(NSF)的流变特性之间进行了比较。针对0.5MNaOH和1MNaOH的情况下的脱胶步骤的方案获得)记录的粘度值显著高于经由标准脱(0.1s_1)，RSF溶液(脱胶步骤0.5MNaOH和1MNaOH)的粘度分别为501.17Pa.s和其取决于缺陷大小并且是强度可变性的量度度和孵育介质诸如在0M至1M之间的NaOH或N[0206]4)处理单元计算作为整体的纤维、丝素蛋白区域和丝胶蛋白区域的横截面面统计学分析产生纤维的每种组分的平均横截面面积以及[0213]从如上文的这些数据集提取[0221]从家蚕蚕茧中提取丝素蛋白如下进行。将蚕茧切碎，并且然后在20mM碳酸钠(≥99.5％,FischerChemical,USA)溶液中以每克生茧(rawcocoon)200mL溶液的比例煮沸。向重构的溶液添加盐增强了稍后由这样的溶液纺丝的任何纤维或由重构的溶液形成的任重构的丝蛋白溶液形成的纤维/材料的性质可[0233]3D图像通过用于共聚焦成像的具有Plan_Apochromat20x/0.8M27(FWD＝0.55mm)物镜的ZeissLSM800共聚焦成像系统(CarlZeissAG,德国)拍摄。从每个样品拍摄至少~90个Z堆叠切片(～33μm)，并且分辨率为约0.105×0.105×0.37μm/像素。通过使用这样的系统可以输入和输出与测量的纤维和/或材料的力学性质相关的数据。在一些实施[0238]通过将由家蚕产生的未经处理的蚕纤维和经处理的蚕纤维粘合在具有20mm标距的中间层。单根纤维的准静态拉伸测试用配备有10N测力传感器的Instron5965万能测试(εt单因素方差分析(ANOVA)，以确定实验组的平均值之间是否存在显著差异，如图13中示出[0241]使用配备有ATRSmartiTX(衰减全反射)附件的NicoletiS50FT_IR光谱仪获得β_转角(1673cm_1)和反平行淀粉样蛋白[0245]在～1720cm_1_1600cm_1之间的所有IR光谱(整体FT_IR和纳米IR)是线性基线化的拟合收敛，并且Chi_Sqr容差值为1E_6。这些峰的二级结构解释为：对于分子间β_片层为反平行淀粉样蛋白β_片层为1695cm_1和放置到铝柱(aluminumstub)上并用[0251]使用在50kV和200mA操作的具有旋转Cu阳极的TTRAXIII(Rigaku,日本)θ_θ衍射曲的石墨单色仪和PMT检测器在衍射光束中对齐，并且θ/2θ扫描在具有可变狭缝的Bragg_[0260]使用HR_20Discovery混合流变仪(TAInstruments,US)使用40mm直径的铝平行板何残余应力。接下来，在应变为0.02(在材料的线性弹性区域内)和角频率为100rad/s至质/肽的振动光谱由两个主要谱带表征，即酰胺I(1600cm_1_1700cm_1)和酰胺II(1480cm_1_曲以及4.5％的β_转角，而采用NaOH程序的脱胶的纤维分别含有20％_24％和8.7％_的纤维之间二级结构的轻微变化导致我们测试构成纤维的原纤维束之间相互作用结合水[0264]进行X射线分析以探测经处理的纤维的结晶分数的差异，并且进行凝胶电泳以检曲)形式存在。这两种形式之间的精细平衡的结晶间距为和2.3A,如图4B中描绘的)指示为β_片层晶型的丝II结构，并且因此提供关于蛋白质链的另外的信息。在图4A中总结的结果揭示了经由使用基于[0266]与NaOH处理的样品相比，对基于Na2CO3的标准方案的可溶性丝素蛋白析。与NaOH处理的样品相比，基于Na2CO3的方案的结果包含非常少量的纳米隔室(nanocompartment)和更多的板(slab)。纳米隔室是稳定蚕腺体中可溶性丝素自天然丝和从不同脱胶方法获得的可溶性RSF的散射矢从0.1s_1增加至500s_1并从500s_1回到0.1s_1两次。分析了以下样品：经由在存NaOH0.5M的情况下脱胶的丝纤维的化学再溶解获得的RSF溶液。该图展示了1(图11B)和响应于施加的剪切的粘度变化，其中剪切速率从0.1s_1增加至500s_1并从500s_1降低回到NaOH和1MNaOH的情况下的脱胶步骤的方案获得)记录的粘度值显著高于经由标准脱胶方NaOH脱胶的纤维重构的溶液的粘度在500s_1剪切速率时为0.25Pa.s。在最小剪切速率(0.1s_1)，RSF溶液(脱胶步骤0.5MNaOH和1MNaOH)的粘度分别为501.17Pa.s和_3的水电子密度。将数据相对于均匀圆盘[0281]基于每个模型在零散射矢量下的强度和每个模型的体积的贡献，计算了图11A中值以及在从共聚焦显微镜分析获得的值之间几