ISO 206312024 婴儿配方奶粉和成人营养品-通过三酶提取和超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MSMS）测定总叶酸含量标准立项发展报告

婴儿配方奶粉和成人营养品——通过三酶提取和超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MS/MS）测定总叶酸含量标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:Infantformulaandadultnutritionals—Determinationoftotalfolatecontentbytrienzymeextractionandultrahighperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry(UHPLC-MS/MS)摘要叶酸作为人体必需的B族维生素，在核苷酸合成、氨基酸代谢及细胞分裂等关键生理过程中发挥着不可替代的作用，其准确测定对婴幼儿和成人营养健康具有重要意义。随着全球婴幼儿配方食品和成人营养品产业的快速发展，以及营养标签法规对叶酸标示要求的日益严格，建立高效、准确、可靠的总叶酸检测方法成为国际食品标准化领域的重要课题。本报告围绕国际标准化组织（ISO）于2024年7月1日正式发布的标准ISO20631:2024《婴儿配方奶粉和成人营养品——通过三酶提取和超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MS/MS）测定总叶酸含量》，系统阐述了该标准的立项背景、技术原理、方法流程及应用价值。该标准采用三酶提取技术与UHPLC-MS/MS联用策略，实现了对食品基质中天然叶酸和添加叶酸的准确、同步定量，有效解决了传统微生物法操作繁琐、耗时较长、特异性不足等技术瓶颈，显著提升了检测效率和方法选择性。本报告还对该标准的修订单位、技术要点、实施意义及未来发展趋势进行了深入分析，旨在为食品检验检测机构、营养品生产企业及相关科研单位提供系统、全面的技术参考和实施指南。关键词：叶酸测定；婴儿配方奶粉；成人营养品；三酶提取；超高效液相色谱-串联质谱；国际标准；食品安全AbstractFolate,asanessentialB-groupvitaminforthehumanbody,playsanirreplaceableroleinkeyphysiologicalprocessessuchasnucleotidesynthesis,aminoacidmetabolism,andcelldivision,anditsaccuratedeterminationisofgreatsignificanceforinfantandadultnutritionalhealth.Withtherapiddevelopmentoftheglobalinfantformulaandadultnutritionalsindustry,aswellasincreasinglystringentrequirementsforfolatelabelinginnutritionlabelingregulations,establishinganefficient,accurate,andreliablemethodfortotalfolatedeterminationhasbecomeanimportanttopicinthefieldofinternationalfoodstandardization.Thisreportsystematicallyelaboratesonthebackground,technicalprinciples,methodologicalprocedures,andapplicationvalueofthestandardISO20631:2024"Infantformulaandadultnutritionals—Determinationoftotalfolatecontentbytrienzymeextractionandultrahighperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry(UHPLC-MS/MS)"officiallypublishedbytheInternationalOrganizationforStandardization(ISO)onJuly1,2024.ThisstandardadoptsacombinedstrategyoftrienzymeextractionandUHPLC-MS/MStoachieveaccurateandsimultaneousquantificationofnaturalfolatesandaddedfolicacidinfoodmatrices,effectivelyaddressingthetechnicallimitationsoftraditionalmicrobiologicalassays,includingcumbersomeoperations,longanalysistime,andinsufficientspecificity,whilesignificantlyimprovingdetectionefficiencyandmethodselectivity.Thisreportalsoprovidesanin-depthanalysisoftherevisingorganizations,technicalhighlights,implementationsignificance,andfuturedevelopmenttrendsofthisstandard,aimingtoprovidesystematicandcomprehensivetechnicalreferencesandimplementationguidanceforfoodinspectionandtestinginstitutions,nutritionalproductmanufacturers,andrelatedresearchunits.Keywords:Folatedetermination;Infantformula;Adultnutritionals;Trienzymeextraction;UHPLC-MS/MS;Internationalstandard;Foodsafety1引言1.1研究背景叶酸（Folate），又称维生素B9，是一类水溶性B族维生素的总称，包括天然存在的多种叶酸衍生物（如四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸等）以及人工合成的氧化态叶酸（Folicacid）。叶酸在人体内参与一碳单位代谢、DNA合成与修复、同型半胱氨酸再甲基化等重要生化过程，对于细胞增殖和组织生长具有关键作用。对于婴幼儿而言，叶酸缺乏可能导致神经管发育缺陷、巨幼细胞性贫血及生长发育迟缓等严重后果；对于成人而言，叶酸摄入不足与高同型半胱氨酸血症、心血管疾病风险增加及某些恶性肿瘤的发生密切相关。基于叶酸的重要营养学意义，世界各国普遍将其列为婴幼儿配方食品和特殊医学用途配方食品的强制标示营养素。国际食品法典委员会（CodexAlimentariusCommission,CAC）在其《婴儿配方食品标准》（CodexStan72-1981）和《较大婴儿配方食品标准》（CodexStan156-1987）中均对叶酸的最低含量做出了明确规定。中国国家标准GB10765-2021《食品安全国家标准婴儿配方食品》和GB10767-2021《食品安全国家标准较大婴儿配方食品》同样将叶酸列为必需营养成分，并规定了相应的含量范围。欧盟委员会指令2006/141/EC以及美国FDA的相关法规也对婴幼儿配方食品中叶酸的添加量及检测提出了明确要求。然而，准确的叶酸含量测定一直是食品分析领域的难点之一。其挑战主要来自以下几个方面：第一，食品基质中叶酸以多种化学形式存在，不同形式的稳定性差异显著；第二，天然叶酸与合成叶酸在化学结构上的差异（蝶啶环的氧化状态）要求检测方法需同时兼顾两类化合物的准确定量；第三，食品中蛋白质、脂质、多糖等复杂基质成分对叶酸的提取和检测可能产生干扰；第四，叶酸对光、热、氧及pH条件较为敏感，在样品前处理过程中易发生降解或相互转化。1.2传统检测方法的局限性长期以来，叶酸的测定主要依赖于微生物法（MicrobiologicalAssay,MBA），即利用叶酸依赖型菌株（如干酪乳酸杆菌*Lactobacilluscasei*亚种*rhamnosus*）的生长量与培养基中叶酸含量呈正相关的原理进行定量分析。该方法被多个国际标准组织采纳，包括ISO14131:2005、AOAC960.46及中国国家标准GB5009.211-2022《食品安全国家标准食品中叶酸的测定》中的第一法等。然而，微生物法在实际应用中暴露出诸多不足：1.操作繁琐且周期长：微生物法需进行菌种活化、接种、培养等步骤，整体测定周期通常需要24～48小时，无法满足快速检测的需求。2.特异性有限：微生物法无法区分不同形式的叶酸衍生物，只能测定总叶酸活性，且某些非叶酸物质（如对氨基苯甲酸）可能刺激菌株生长，产生假阳性结果。3.重现性较差：微生物法对菌株活性、培养基质量、培养条件等敏感，不同实验室间的结果一致性难以保证。4.无法反映叶酸分布信息：微生物法仅能提供总叶酸含量数据，无法提供各叶酸衍生物的组成分布信息。随着液相色谱-质谱联用技术的迅速发展，特别是超高效液相色谱（UHPLC）与串联质谱（MS/MS）联用技术的日益成熟，利用仪器分析方法替代微生物法进行叶酸测定的可行性显著提升。液相色谱法（如HPLC-UV或HPLC-FLD）虽可实现叶酸衍生物的分离和检测，但其灵敏度和选择性难以满足复杂基质中痕量叶酸（尤其是天然叶酸）的准确测定需求。相比之下，UHPLC-MS/MS技术凭借其高分离效能、高灵敏度和高选择性，已成为食品中维生素测定的主流技术方向。1.3标准立项的必要性在上述背景下，制定一项基于三酶提取和UHPLC-MS/MS技术的总叶酸测定国际标准具有迫切的必要性：第一，满足法规和贸易需求。各国营养标签法规持续更新，对叶酸的标示精度要求不断提高，亟需建立与国际接轨的准确检测方法。统一的标准方法有助于消除技术性贸易壁垒，促进婴幼儿配方食品和成人营养品的国际贸易。第二，弥补现有标准不足。ISO20631:2024标准的制定旨在弥补ISO14131:2005（基于微生物法）在分析效率和特异性方面的不足，为食品检验机构提供一种更加高效、可靠的替代方法。第三，顺应技术发展。近年来，三酶提取技术在叶酸分析中的应用日趋成熟，已成为有效释放食品基质中结合态叶酸的前处理手段。将这一技术与国际上广泛认可的UHPLC-MS/MS检测技术相结合，代表了叶酸测定方法的重要发展方向。因此，国际标准化组织食品技术委员会（ISO/TC34）启动了对该标准的制定工作，经过多轮国际协作研究和实验室间验证，最终形成了ISO20631:2024这一正式国际标准。2标准概况与适用范围2.1标准基本信息ISO20631:2024《婴儿配方奶粉和成人营养品——通过三酶提取和超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MS/MS）测定总叶酸含量》由国际标准化组织（InternationalOrganizationforStandardization,ISO）正式发布，其标准编号为ISO20631:2024，发布日期为2024年7月1日。该标准现行有效，文件格式为电子版加密PDF，文件大小约1分钟可下载，含水印，需安装FileOpen插件方可阅读，使用电脑需保持联网状态，且限制累计3台电脑共打印5次。该标准的官方售价为808.0元人民币。2.2适用范围与对象本标准适用于婴儿配方奶粉和成人营养品两类基质中总叶酸含量的测定。具体而言，包括以乳基或植物基为基础的婴儿配方奶粉（包括一段、二段及三段配方食品）、较大婴幼儿配方食品，以及面向成人使用的全营养配方食品、特定疾病人群营养食品和运动营养食品等。该标准的总叶酸定义为天然存在的各类叶酸衍生物（主要包括四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸、10-甲酰叶酸及5,10-亚甲基四氢叶酸等还原型叶酸）与合成添加的氧化态叶酸（蝶酰谷氨酸）的总和。标准所述的检测方法涵盖了从样品前处理、三酶提取、固相萃取净化到UHPLC-MS/MS检测及定量分析的全流程技术方案。2.3标准的国际地位作为国际标准化组织（ISO）发布的标准，ISO20631:2024在食品分析领域具有广泛的国际认可度和影响力。ISO/TC34（食品技术委员会）作为本标准的技术归口组织，其框架下制定的食品检测方法标准为世界各国普遍采用，常被转化为国家标准或区域性标准，也是国际贸易中实验室检测结果互认的重要依据。3技术方案概述3.1方法原理ISO20631:2024所建立的总叶酸测定方法基于以下核心原理：在适宜的缓冲液体系中，利用α-淀粉酶、蛋白酶和叶酸轭合酶（也称为“三重酶体系”）对样品进行协同酶解处理。其中，α-淀粉酶负责将样品中的淀粉类多糖分解为小分子糖类，降低溶液黏度并释放被包裹的叶酸；蛋白酶则将蛋白质基质水解为氨基酸和小肽，破坏蛋白质与叶酸之间的结合作用；叶酸轭合酶（γ-谷氨酰水解酶）则特异性地切割多聚谷氨酸叶酸链中的γ-谷氨酰键，将多聚谷氨酸形式转化为可被检测的单谷氨酸形式。经过上述三酶联合处理后，样品中以各种形式存在的总叶酸被统一转化为可检测的形式，随后通过固相萃取柱进行净化富集。净化后的样品经超高效液相色谱系统进行色谱分离，以反相C18色谱柱为固定相，采用梯度洗脱程序实现各叶酸衍生物的基线分离，随后在电喷雾离子源（ESI）正离子模式下电离，进入串联四极杆质谱分析器进行多反应监测（MRM）模式检测。通过内标法进行定量，以氘代或¹³C标记的叶酸类似物为内标物（如¹³C₅-叶酸），以校正样品前处理过程中的回收损失和基质效应。3.2关键步骤标准的分析流程主要包括以下关键步骤：1.样品均质与称量：准确称取一定量的均匀化样品（通常为0.5～2.0g），记录精确质量。2.三酶提取：在含抗氧化剂（如抗坏血酸和2-巯基乙醇）的缓冲液中分散样品，依次加入α-淀粉酶、蛋白酶和叶酸轭合酶，在37°C条件下孵育适当时间（通常为2～4小时），使结合态叶酸充分释放并转化为可检测形式。酶解完成后，通过加热（如100°C保持5分钟）灭活酶活性。3.净化与富集：酶解液经离心和过滤后，通过阴离子交换固相萃取柱（如强阴离子交换SAX柱）进行净化和富集。目标物以含盐缓冲液洗脱，洗脱液经稀释或浓缩后进样分析。4.UHPLC-MS/MS分析：取适量净化后的样品溶液注入UHPLC-MS/MS系统。色谱条件通常包括：C18反相色谱柱（如2.1mm×100mm，1.7μm粒径），柱温30～40°C，流动相为含甲酸的乙腈-水体系，流速0.3～0.4mL/min，梯度洗脱。质谱条件：电喷雾正离子模式，多反应监测模式采集，监测各叶酸衍生物的特征母离子→子离子对。5.定量分析：以标准曲线法定量或内标法定量计算样品中各叶酸衍生物的含量。各类叶酸衍生物的浓度分别计算后加和，得到样品中总叶酸的含量。3.3方法性能指标根据标准所附的实验室间验证结果，该方法的性能指标如下：定量限（LOQ）可达到5μg/100g（以叶酸计），远低于各类食品标准中叶酸的最低添加量要求，可满足日常监管的需要；回收率范围为85%～110%，相对标准偏差（RSD）在5%～10%之间，表明方法具有良好的准确性和精密度。3.4与传统方法的对比优势相较于ISO14131:2005所确立的微生物法，ISO20631:2024提出的新方法呈现以下显著优势：|对比维度|微生物法（ISO14131）|UHPLC-MS/MS法（ISO20631）||---------|---------------------|---------------------------||分析周期|24～48小时|2～4小时（含前处理）||特异性|较差，无法区分叶酸衍生物|高，可实现各衍生物单独定量||重现性|较差，受菌株和培养条件影响大|良好，RSD通常＜10%||自动化程度|较低，人工操作步骤多|较高，可批量自动化处理||衍生化信息|无法获取|可获取各叶酸衍生物组成分布||基质干扰|可能产生假阳性|通过内标和色谱分离有效消除|这些优势显著提升了检测效率和结果可靠性，使该标准成为微生物法的重要补充和替代选项。4主要修订单位与技术支持4.1标准制定组织框架ISO20631:2024的制定工作由国际标准化组织食品技术委员会（ISO/TC34）下属的“水果、蔬菜及其衍生物”分技术委员会（SC3）或相关工作组（WG）负责推进。ISO/TC34成立于1947年，是ISO中规模最大、最活跃的技术委员会之一，负责食品领域的标准化工作，其秘书处由法国标准化协会（AFNOR）承担。ISO/TC34的工作范围涵盖食品分析方法、农产品质量要求、感官分析、微生物学、营养与特殊膳食用食品等多个方向，其发布的标准在全球范围内具有广泛的认可度和应用价值。叶酸测定相关标准在ISO/TC34体系内经历了长期的演进和完善。1995年，ISO首次发布了基于微生物法的叶酸测定标准ISO14131:1995，随后在2005年进行了修订确认。然而，随着液相色谱-质谱技术的快速发展，ISO/TC34各成员国逐渐认识到基于微生物法的传统标准已经难以完全适应现代食品检测技术发展的需求，有必要制定一项基于现代仪器分析技术的补充标准。为此，ISO/TC34于2016年前后启动了新工作项目提案（NewWorkItemProposal,NWIP），正式提出制定基于三酶提取和UHPLC-MS/MS技术的总叶酸测定标准。来自美国、德国、中国、法国、日本等国的多名专家共同参与了该标准的起草和技术验证工作。4.2核心技术支持单位介绍在本标准的制定过程中，美国食品药品监督管理局（U.S.FoodandDrugAdministration,FDA）国家