T∕NXZX 060-2025 废弃牛奶乳源ACE抑制肽含量的测定-HPLC-MS MS法

ICS.67.100.01CCSX16定-HPLC-MS/MS法DeterminationofACEinhibitorypeptidecontentinwastemilksourceby宁夏质量技术协会发布I前言 II 2规范性引用文件 3术语和定义 4方法原理 5试剂和材料 6仪器设备 7分析步骤 8结果计算 9精密度 10检出限和定量限 本标准依据GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本标准所有内容应符合强制性国家标准、行业标准及地方标准，若与其相抵触时，以国家标准、行业标准、地方标准为准。本标准由宁夏计量质量检验检测研究院提出。本文件由宁夏质量技术协会归口。本标准起草单位：宁夏计量质量检验检测研究院、蒙牛（银川）乳品有限公司、国智（宁夏）知识产权服务有限公司。本标准主要起草人：谭勋哲、银鑫叶、刘杰、张静旖、田菊梅、简敏捷、吕晓东、方向阳、米江、赵燕、姚博伟、魏建设、段斌、刘杨琼、魏金娥、周慧、石亚东、王俊。废弃牛奶乳源ACE抑制肽含量的测定-HPLC-MS/MS法本标准规定了使用高效液相色谱-串联质谱联用（HPLC-MS/MS）技术对废弃牛奶乳源中特定血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽进行定性鉴定、确认和定量分析的方法。本标准适用于对废弃牛奶及其制品（包括因品质、保质期、加工剩余等原因未用于直接食用的液态、固态或半固态废弃乳制品）中已知氨基酸序列的单一或多种ACE抑制肽进行定性确认和定量分析。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法NY/T4746-2025饲料中杆菌肽的测定高效液相色谱-串联质谱法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1废弃牛奶wastemilk因不符合商品标准、超过保质期、加工剩余或其他原因未被直接用于食品消费的牛奶及其液态或固态制品。3.2ACE抑制肽ACEinhibitorypeptide能够抑制血管紧张素转化酶（ACE）活性，从而具有潜在降血压功能的多肽片段。3.3特征离子对characteristicionpair目标分析物在质谱中经碰撞诱导解离产生的，用于定性识别的母离子和子离子组合。通常选择响应强度高、干扰少的离子对。3.4保留时间retentiontime目标分析物从色谱柱进样到出现色谱峰最大值所需的时间。3.5多反应监测multiplereactionmonitoring(MRM)一种串联质谱扫描模式，通过选择特定的母离子，并监测其碰撞后产生的特定子离子，实现对目标化合物的高选择性、高灵敏度检测。4方法原理试样经提取、净化后，采用高效液相色谱（HPLC）分离，目标ACE抑制肽在色谱柱上实现与其他组分的分离。进入质谱（MS）检测器后，在电喷雾离子源（ESI）正离子模式下进行电离，采用多反应检测（MRM）模式对目标肽的特征离子对进行检测。以目标肽标准品的保留时间和特征离子对进行定性分析，以色谱峰面积外标法定量。5试剂和材料除另有说明外，所有试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682规定的一级水要求。5.1标准品目标ACE抑制肽标准品：纯度≥98%（或已知的确切纯度）。应明确其氨基酸序列和分子量。5.2试剂5.2.1乙腈（CH3CN）：色谱纯。5.2.2甲醇（CH3OH）：色谱纯。5.2.3甲酸（HCOOH）：色谱纯。5.2.4甲酸铵（HCOONH4）：色谱纯。5.2.5三氟乙酸（TFA）：色谱纯。5.2.6乙酸（CH3COOH）：色谱纯。5.2.7超纯水。5.3溶液配置5.3.1甲酸水溶液（0.1%，v/v）：准确量取1.0mL甲酸（5.2.3），用水稀释并定容至1000mL，混匀。5.3.2甲酸乙腈溶液（0.1%，v/v）：准确量取1.0mL甲酸（5.2.3），用乙腈（5.2.1）稀释并定容至1000mL，混匀。5.3.3甲酸铵水溶液（10mmol/L）：准确称取0.630g的甲酸铵（5.2.4），用超纯水溶解并定容，混匀。5.3.4乙腈-水溶液（50%，v/v）：准确量取500mL乙腈（5.2.1）与500mL超纯水混合。5.3.5标准储备溶液（1.0mg/mL准确称取适量目标ACE抑制肽标准品（5.1用0.1%甲酸水溶液或水-乙腈混合溶液溶解并定容，于-20℃以下避光保存，有效期3个月。5.3.6标准工作溶液：根据需要，用初始流动相或样品基质空白溶液将标准储备溶液（5.3.5）逐级稀释成一系列不同浓度的标准工作溶液，现用现配。6仪器设备6.1高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（HPLC-MS/MS），配有电喷雾离子源（ESI）。6.2分析天平：感量0.01mg和0.1mg。6.3超声波清洗器。6.4涡旋混合器。6.5离心机：转速不低于10000r/min。6.6微量移液器。6.7pH计。6.80.22μm微孔滤膜。6.9超滤离心装置。7分析步骤7.1试样制备7.1.1样品预处理废弃牛奶样品可能含有沉淀、异物或微生物污染，取样前应充分混匀（液态）或均质（固态/半固态），必要时可通过纱布或筛网进行初步过滤，去除可见杂质。7.1.2固体/半固体样品准确称取均匀试样1.0g（精确至0.1mg）于50mL离心管中，加入10mL预冷的0.1%甲酸水溶液（5.3.1），涡旋振荡2min，超声提取20min，于4℃、10000r/min离心10min，取上清液。残渣重复提取2~3次，合并上清液。用0.1%甲酸水溶液定容至25mL容量瓶，经0.22μm滤膜过滤后，供HPLC-MS/MS分析。7.1.3液体样品准确量取均匀试样1.0mL于容量瓶中，用0.1%甲酸水溶液（5.3.1）稀释定容，涡旋混匀，经0.22μm滤膜过滤后，供HPLC-MS/MS分析。7.1.4高脂肪/高蛋白样品加入等体积乙腈（5.2.1）沉淀蛋白，涡旋混匀后离心，取上清液用0.1%甲酸水溶液稀释并过滤，随后于4℃、10000r/min离心10min。定量转移全部上清液进行后续操作。7.2HPLC-MS/MS测定由于测试结果取决于所使用的仪器，因此无法给出液相色谱及质谱分析的通用参数，设定的参数应保证色谱测试时被测组分与其他组分能够得到有效的分离。典型质谱条件可参考：采用电喷雾离子源（ESI），正离子模式，多反应监测（MRM）模式进行数据采集。质谱条件的设定、数据采集与处理可参考NY/T4746-2025中HPLC-MS/MS法的相关原则，附录A给出的示例已证明是可行的。7.3定性分析在相同实验条件下，试样中目标肽的保留时间与标准工作溶液中目标肽的保留时间相比，相对偏差应在±2.5%以内。并且，试样中目标肽的特征离子对的相对丰度（与浓度最高的子离子比较）与标准工作溶液的相对丰度一致。满足上述条件，可判定样品中存在对应的目标ACE抑制肽。7.4定量测定7.4.1标准曲线的绘制将标准工作溶液（5.3.6）由低浓度到高浓度依次进样测定，记录目标肽的色谱峰面积。以标准工作溶液的浓度为横坐标，对应的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线的线性相关系数（r）应不低于0.995。7.4.2试样测定将制备好的试样溶液（7.1）按7.2的仪器条件进样分析，记录目标肽的色谱峰面积。根据标准曲线得到试样溶液中目标肽的浓度。7.5空白试验除不加试样外，采用完全相同的分析步骤进行空白试验。8结果计算8.1.1对于按7.1.1或7.1.2制备的常规试样，目标ACE抑制肽的含量结果直接按公式（1）计算：X式中：X—试样中目标ACE抑制肽的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/Lc—由标准曲线计算得到的试样溶液中目标肽的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；c0—由标准曲线计算得到的空白溶液中目标肽的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mLV—试样定容体积，单位为毫升（mL）；f—单位换算因子（示例中为10-6，将ng转换为mg）；D—稀释倍数；m—试样质量或体积，单位为克（g）或毫升（mL）；P—标准品的纯度（以小数表示）。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留三位有效数字。8.1.2对于按7.1.3制备的高脂肪/高蛋白试样，由于在提取步骤中加入了沉淀剂（纯乙腈）并可能弃去部分沉淀，公式（1）中的相关参数应按以下原则确定：（1）试样质量或体积（m）：指实际用于提取、并在最终上机液中有所贡献的那部分原始试样的质量或体积。通常，称取1.0g样品，加入10mL乙腈（5.2.1）沉淀后离心，取全部上清液进行后续处理，则m=1.0g。（2）稀释倍数（D）和定容体积（V）：需完整考虑整个前处理过程中的所有稀释和分取步骤。通常，取上述全部上清液（约10mL）用0.1%甲酸水定容至25mL，则V=25mL，且此步骤已包含在从原始提取液到最终试液的稀释过程中，应计入D。计算公式的形式不变，但使用者在计算时必须根据实际前处理流程，准确核算m、V和D的数值。9精密度在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。10检出限和定量限当取样量为1.0g（或1.0mL），定容体积为25mL时，本方法的检出限（LOD）为0.1μg/kg（或0.1μg/L），定量限（LOQ）为0.5μg/kg（或0.5μg/L）。具体数值需根据实际目标肽的仪器响应进行验证。附录A（资料性）ACE抑制肽的测定示例仅以某型号HPLC-MS/MS得到验证的参数为例提供参考，其他型号液相色谱-质谱串联仪的工作条件可根据各自仪器的具体情况而定。（a）液相色谱条件由于目标肽的极性不同，色谱柱和流动相可进行调整，以下为参考条件：1）色谱柱：C18色谱柱（柱长100mm，内径2.1mm，粒径1.7μm或1.8μm），或等效柱。2）流动相：A相：0.1%甲酸水溶液（含10mmol/L甲酸铵）（5.3.3）；B相：0.1%甲酸乙腈溶液（5.3.2）。3）梯度洗脱程序：①短梯度程序（适用于目标肽较少的样品）：0min~2min：95%A+5%B；2min~8min：95%A→60%A，5%B→40%B；8min~10min：60%A→5%A，40%B→95%B；10min~12min：5%A+95%B；12.1min~15min：95%A+5%B。②长梯度程序（适用于复杂肽段混合物分离）：0min~70min：5%B→35%B，线性梯度；70.1min~75min：35%B→95%B；75.1min~85min：95%A+5%B。4）流速：0.3mL/min。5）柱温：40℃。6）进样量：5μL~10μL。（b）质谱条件1）离子源：电喷雾离子源（ESI）。2）扫描模式：正离子模式。3）检测方式：多反应监测（MRM）。4）电喷雾电压（IS）：4500V~5500V（视仪器优化）。5）离子源温度（TEM）：500℃~600℃。6）雾化气（G