CN119464168A 一种生产人乳寡糖的方法 （天津科技大学）

种murA和ygeA基因的突变体及其在生产人乳寡22.如权利要求1所述的一株生产人乳寡糖的底盘菌株因进行弱化表达的方法是将其突变为SEQ对YgeA的编码基因进行突变的方法是将其突变为SEQIDNO.6所示的YgeA突变体的编3.如权利要求1所述的生产人乳寡糖的底盘4.权利要求1所述底盘菌株在生产人乳寡所述lgtB基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所述wbgO基因的核苷酸序列如SEQIDNO.13[0002]人乳寡糖(Humanmilkoligosaccharides，HMOs)是存在于母乳中的一类重要低6P）在pgi编码的葡萄糖6磷酸异构酶的催化下转化为果糖6磷酸（F6PF6P依次在码的N乙酰氨基葡萄糖1磷酸尿苷转移酶/氨基葡萄糖1磷酸乙酰转移酶的催化下转化为尿苷二磷酸一N乙酰基葡萄糖胺（UDPGlcNAc在另一前体尿苷二磷酸半乳糖（UDPUDPN乙酰氨基葡萄糖2差向异构酶NeuC、N乙酰神经氨酸合酶NeuB和N乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶NeuA的催化作用下合成胞苷单磷酸一N一乙酰神经氨酸CMP一Neu5Ac。CMP一Neu5Ac在α2,3唾液酸转移酶α2,3SiaT和α2,6唾液酸转移酶α2,6SiaT的催化作用下与4表达lacY，并进一步对MurA的编码基因进行弱化表达，和/或对YgeA的编码基因进行突变进一步地，对MurA的编码基因进行弱化表达的方法是将进一步地，对YgeA的编码基因进行突变的方法是将更进一步地，在上述底盘菌的基础上进一步过表达N_乙酰神经氨酸合酶编码菌的基础上表达pTrc99a_PJ23119_neuB_neuC_Ptrc_neuA_ist质粒，获得一株生产3'_SL的菌更进一步地，在上述底盘菌的基础上进一步过表达N_乙酰神经氨酸合酶编码5盘菌的基础上表达pTrc99a_PJ23119_neuB_neuC_Ptrc_neuA_ST6质粒，获得一株生产6'_SL的所述pTrc99a_PJ23119_neuB_neuC_Ptrc_neuA_ist质粒和pTrc99a_PJ23119_neuB_neuC_Ptrc_neuA_ST6质粒的具体构建过程参考专利CN1177本发明通过基因编辑技术获得一种MurA和YgeA突变体，将其应用于生产LNTII、野生型YgeA的Thr替换成Ala，位置的编号对应于SEQIDNO.7中野生型YgeA的氨基酸序列6VDKFRVQGPTKLQGEVTISGAKNAALPILFAALLAEEPVEIQNVPKLKDVDTSMKLLSQLGAKVERNGSVHIDARDVNVFCAPYDLVKTMRASIWALGPLVARFGQGQVSLPGGCTIGARPVDLHISGLEQLGATIKLEEGYVKASVDGRLKGAHIVMDKVSVGATVTIMCAATLAEGTTIIENAAREPEIVDTANFLITLGAKISGQGTDRIVIEGVERLGGGVYRVLPDRIETGTFLVAAAISRGKIICRNAQPDTLDAVLAKLRDAGADIEVGEDWISLDMHGKRPKAVNVRTAPHPAFPTDMQAQFTLLNLVAEGTGFITETVFENRFMHVPELSRMGAHAEIESNTVICHGVEKLSGAQVMATDLRASASLVLAGCIAEGTTVVDRIYHIDRGYERIEDKLRALGANIERVMKTIGLLGGMSWESTIPYYRLINEGIKQRLGGLHSAQVLLHSVDFHEIEECQRRGEWDKTGDILAEAALGLQRAGAEGIVLCTNTMHKVADAIESRCTLPFLHIADATGRAITGAGMTRVALLGTRYTMEQDFYRGRLTEQFSINCLIPEADERAKINQIIFEELCLGQFTEASRAYCAQVIARLAEQGAQGVIFGCAEIGLLVPEERSVLPVFDTAAIH以大肠杆菌K12MG1655(EscherichiacoliK12MG1655)为出发菌株构建，利用CRISPR/Cas9技术(ZhaoD,etal.CRISPR/Cas9_assistedgRNA_freeone_stepgenomeeditingwithnosequencelimitationsandimprovedtargetingefficiency.SciRep7,16624)敲除出发菌株的乳糖操纵子序列中的lacZ，在原lacZ位点之后以Ptrc启动子同源重组片段的构建以实验室保存的MG1655野生型菌株为模板，分别利用表1中体为模板，利用引物对lac_cat_f/r为引物进行PCR扩增，获得带有cat_N20序列（SEQIDtrc[0026]第一步同源重组利用常规的质粒转化法将pCAGO质粒转化到大肠杆菌K12MG16557[0027]第二步同源重组将一次重组验证成功的菌株接种至含100μg/mLAMP和0.1mM在H0菌株的基础上，利用CRISPR/Cas9技术(ZhaoD,etal.CRISPR/Cas9_assistedgRNA_freeone_stepgenomeeditingwithnosequencelimitationsandimprovedtargetingefficiency.SciRep7,16624)将murA基因的第1位核苷酸腺嘌呤突同源重组片段的构建以实验室保存的MG1655野生型菌株为模板，分别利用表2中型murA核苷酸序列的第1位核苷酸腺嘌呤[0030]第一步同源重组利用常规的质粒转化法将pCAGO质粒转化到菌株H0中，获得菌株8[0031]第二步同源重组将一次重组验证成功的菌株接种至含100μg/mLAMP和0.1mM分别在菌株H0和H1的基础上，利用CRISPR/Cas9技术(ZhaoD,etal.CRISPR/Cas9_assistedgRNA_freeone_stepgenomeeditingwithnosequencelimitationsandimprovedtargetingefficiency.SciRep7,16624)将ygeA基因的第592位核苷酸腺以实验室保存的MG1655野生型菌株为模板，分别利用表3中的引物构建同源重组9为：gcgcaacgcaattaatgtgagttagcgcgaattgatctggtttgacagcttatcatcgactgcacggtgcaccaatgcttctggcgtcaggcagccatcggaagctgtggtatggctgtgcaggtcgtaaatcactgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactcccgttctggataatgttttttgcgccgacatcataacggttctggcaaatattctgaaatgagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatctcacacaggaaaca[0038]以质粒pTrc99a为模板，以表4中的99a_F/R为引物进行PCR扩增，获得线性载体养，挑取转化子进行菌落PCR以及测序验证，获得正确的重组质粒，命名为质粒pTrc99a_在质粒pTrc99a_Ptrc_lgtA的基础上构建质粒pTrc99a_Ptrc_lgtB_lgtA。以质粒pTrc99a_Ptrc_lgtA为模板，以表5中的lgtA_F和99a_R为引物进行PCR扩增，获得线性载体pTrc99a_粒pTrc99a_Ptrc_lgtA的基础上构建质粒pTrc99a_Ptrc_wbgO_lgtA。以质粒pTrc99a_Ptrc_lgtA为模板，以表6中的lgtA_F和99a_（SEQIDNO.12所示将上述PCR获得的线性载体和线性基因片段纯化、回收，使用利用电转化的方法，将质粒pTrc99a_Ptrc_lgtA、pTrc99a_Ptrc_lgtB_lgtA、pTrc99a_Ptrc_wbgO_lgtA、pTrc99a_PJ23119_neuB_neuC_Ptrc_neuA_ist和pTrc99a_PJ23119_neuB_neuC_Ptrc_neuA_ST6（质粒pTrc99a_PJ23119_neuB_neuC_Ptrc_neuA_ist和pTrc99a_PJ23119_neuB_neuC_Ptrc_neuA_ST6的具体构建过程参考专利CN117736280A实施例2和实施例G5[H0(pTrc99a_Ptrc_lgtBG6[H1(pTrc99a_Ptrc_lgtBG7[H2(pTrc99a_Ptrc_lgtBG8[H3(pTrc99a_Ptrc_lgtBG9[H0(pTrc99a_Ptrc_wbgOG10[H1(pTrc99a_Ptrc_wbgOG11[H2(pTrc99a_Ptrc_wbgOG12[H3(pTrc99a_Ptrc_wbgOG13[H0(pTrc99a_PJ23119_neuB_neuC_Ptrc_neuG14[H1(pTrc99a_PJ23119_neuB_neuC_Ptrc_neuG15[H2(pTrc99a_PJ23119_neuB_neuC_Ptrc_neuG16[H3(pTrc99a_PJ23119_neuB_neuC_Ptrc_neuG17[H0(pTrc99a_PJ23119_neuB_neuC_Ptrc_neuG18[H1(pTrc99a_PJ23119_neuB_neuC_Ptrc_neuG19[H2(pTrc99a_PJ23119_neuB_neuC_Ptrc_neuG20[H3(pTrc99a_PJ23119_neuB_neuC_Ptrc_neuMgSO4CoCl2CuCl22ONa2MOO42ONiSO4由表8至表1