医疗机构临床流式细胞实验室建设专家共识

细胞技术临床应用推广组联合国内相关领域专家，在整合ISO15189《医学实验室质量和能力认可准则》、美国临床和实验室标准协会 (ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI)相关指南、国际流式细胞协会(InternationaCytometry,ISAC)实践经验的基础上，结合我国实际国情，制定了流式细胞术作为当前最先进的细胞分析技术之一，自20世纪80的临床应用主要涵盖细胞、蛋白和核酸3个层面。首先，多色荧光分式细胞术已能实现单次检测超过40个参数，尽管其在标准化和数据华医学会检验医学分会临床免疫学组和中国民族卫生协会流式细胞技术临床应用推广组联合国内相关领域专家，在系统整合ISO15189(如2023版《流式细胞术的临床应用专家共识》和2025年《流式细胞术临床检验质量控制专家共识》)的基础上，结合国内临一本共识适用于各级医疗机构临床实验室和第三方医学检验实验共识形成方法2.1共识形成过程制订/修订指南的基本方法及程序。专家组由来自全国各地临床流式细胞领域、临床检验质量管理领域专家组成，共91名，来自全国27和反馈，最终确定16条共识意见。共识制订计划和方案已在国际实2.2证据等级和推荐强度的分级定义2.2.1证据等级C基于专家经验及常识判断。2.2.2推荐强度未达成共识4个级别。强推荐共识为具有A或B级证据支持且同意率 (即选择同意的专家人数比例)≥90%;中推荐共识为具有A或B级证据支持且同意率为80%~89%,或具有C级证据支持且同意率≥90%;弱推荐共识为具有A或B级证据支持且同意率为70%~79%,或具有C级证据支持且同意率为80%~90%;未达成共识为具有A或B级证据支持且同意率<70%,或具有C级证据支持且同意率<80%。三3.1管理要求《医疗机构临床实验室管理办法》(卫医发〔2006〕73号)及相关项目自动化程度有限，操作流程复杂，对实验室管理提出更高要求。《医学实验室质量和能力的要求第1部分：通用要求》(GB/T同时可参考美国病理学家学会(CollegeofAmericanPathologists,3.2临床流式细胞实验室设置优化。(A级，强推荐)3.3检验项目设置合考虑临床需求的适宜性或(和)重要性、技术平台的成熟度、实验如T/B/NK淋巴细胞亚群计数、人类白细胞抗原B27(humanantigenB27,HLA-B27)检测及基于微球流式免疫荧光技术的细胞因检测、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(paroxysmalnocturnalhemoglobinuria,PNH)克隆检测等，应在确保具备相应仪器配置、验项目见表1。检验项目临床应用场景血液肿瘤免疫分型CD34干细胞计数白血病，淋巴骨随编、骨髓增生异常尊行征等血液肿痴的诊和分型。淋巴细胞亚群精细分型(初始/记忆细胞、活化T细胞、耗竭/衰老T细胞、调节性T细胞、浆母细胞、Th细胞亚群、CD4和CD8双阴性T细胞、调节性NK细胞、杀伤性NK细胞等)中性粒细胞表面CD64检测分析淋巴细胞的精细表型，用于机体免疫状态评估、免疫缺陷病筛查、免疫重建评价等。通过检测近期从胸腺新输出的细胞，评估胸腺功能。育不全相关疾病的关键指标。评估肿瘤、慢性感染及炎症性疾病患者体内的免疫抑制状态，为预后判断及免疫治疗策略提供参考。的评估与预后判断。细菌感染的早期辅助诊断及与非感染性炎症的鉴别。免疫细胞功能检测免疫细胞功能检测(胞内细胞因子检测、颗粒酶、穿孔素等)中性粒细胞呼吸爆发试验白介素检测评估免疫细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)中线粒体合征、重症感染、CAR-T治疗后)的辅助诊断、病情监测及预后评估。白介素-2受体检测免疫球蛋白亚型检测噬血细胞综合征的辅助诊断指标，淋巴系统增殖性疾病(如淋巴瘤)、移植物抗宿主病的活动性评估及部分自身免疫病的病情监测。阿尔茨海默病生物标志物检测炎症性疾病、自身免疫病、肿瘤转移等病理过程的机制研究与辅助评估。监测。其他项目精子DNA碎片检测免疫性血小板减少症的诊断与鉴别诊断。男性不育症的病因评估、辅助生殖结局预测。共识2:应基于实验室规模、专科发展及临床需求设置流式细胞(C级，中推荐)4.1实验室负责人实验室负责人负责实验室的各项组织与管理工作。应具备3年以4.2岗位人员验报告做出基本解释。从事HIV/AIDS患者CD4T淋巴细胞检测的人LDT)及性能评价的技术人员，应具备中级及以上专业技术职务任职资格，并拥有≥3年的流式细胞术实践经验，确保能独立设计、优化共识3:鉴于临床流式细胞术的独特性和专业性，实验室应保持技术队伍的相对稳定，以保障检测质量的连续性和技术积累的持续性。 (C级，中推荐)5.1实验室布局实验室总面积应综合考量计划开展的检测项目类型、核心仪器(如流式细胞仪)及配套设备(如冰箱、离心机、生物安全柜)的数胞无菌培养，可参考《细胞培养洁净室设计技术规范》(GB/T42398-2023)的要求设计独立的细胞培养室。共识4:临床流式细胞实验室应设置为相对独立的功能区域，采符合生物安全二级(biosafetylevel2,BSL-2)及以上实验室的建告区等功能分区。(B级，强推荐)共识5:对于拟配置设备及预期检测项目用途尚不明确的待建分5.1.1样本制备区应根据临床工作量、预处理操作时长、检测周转时间 (turn-aroundtime,TAT)要求及样本前处理设备，配备足够的试并据此建立相应的安全操作规范与个人防护要求。对于高风险样本 (如已知含BSL-2及以上病原体、呼吸道样本),应参照BSL-2实验机等设备的数量及其实际占用空间(含操作与维护空间)综合计算。共识6:实验室应基于所处理样本的潜在生物风险进行评估，并据此建立相应的安全操作规范与个人防护要求。(A级，强推荐)5.1.2检测区应充分整合不同仪器制造商的安装条件及使用要求，其中涉及检测精度的关键环境指标(如温湿度控制)应严格遵循设备制造商提供的标准。流式细胞仪等光学精密仪器对环境波动极为敏感。仪器区应避免设置在靠近门窗、空调出风口或可能受阳光直射的位置，以最大限度减少外部环境干扰。程序与应急预案。对于高风险样本(如已知含BSL-2及以上病原体、呼吸道样本)可能产生气溶胶的操作，应在Ⅱ级生物安全柜或经过安效过滤(如高效空气过滤器过滤)和排放，以确保人员与环境安全。共识7:检测区的面积规划应与仪器数量及尺寸相匹配，布局上振动源，以确保检测系统的长期稳定运行。(C级，中推荐)5.1.3结果分析及报告区线分析，可以提升整体工作效率。因项目检测时间和(或)分析时间共识8:结果分析及报告区应配备稳定的计算机系统与专业软件备份与安全管理制度。(C级，中推荐)5.1.4样本及检测试剂耗材储存区存。如需留存，应经过风险评估，并在更高级别的防护条件下(如BSL-3实验室)保存，或经过有效灭活后，按规定在指定设备中短期存放，并由专人(如微生物组指定人员)负责登记和管理。5.2环境及设施要求5.2.1洁净度5.2.2通风检验科实验室6~8次/h的全新风换气要求。质谱流式细胞仪应按照5.2.3温湿度实验室应严格遵循仪器制造商手册的要求制定并记录环境控制标准，并配备必要的温湿度调控设备(如除湿器、加湿器)。5.2.4供电设施置符合仪器厂家要求的稳压器及不间断电源(uninterruptiblepowersupply,UPS)和/或双路电源，以应对突发断电情况，保护关动应<10%,确保仪器安全稳定运行。5.2.5供水设施实验室用水质量直接影响试剂配制和实验结果。应依据用途(如用于试剂配制的超纯水，其电阻率通常要求>18.2MΩ·cm(25℃)。5.2.6供气设施质谱流式细胞仪所用高纯气体(如氩气)的供应，应确保其纯度胞仪，然而目前随着医疗技术的进步，细胞分选也开始应用于临床，例如Epstein-Barr病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)淋巴细胞亚群6.1流式细胞仪的选择6.1.1激光与荧光检测通道配置仪器的激光器应覆盖常规检测所需波段，常见包括488nm(蓝激光)、640nm(红激光)、405nm(紫激光)等。对于单参数或低检测、细胞因子及受体检测、精子DNA碎片检测、DNA倍体检测),可选择经济型单激光或双激光4色仪器；而对于多参数分析需求(如检测),则需配置多激光、多检测器的高端机型，如双激光6通道及以上、三激光8通道及以上等。实验室也可根据临床需求，选择全光选仪同样根据分选细胞所需的检测参数选择相应的激光器和检测器配置。对于复杂免疫分型和稀有细胞的分选，推荐选用3根或以上激6.1.2仪器性能荧光流式细胞仪(分析型)的性能参数应符合行业标准《流式细分选纯度、分选回收率、分选后细胞存活率、分选速度与准确性(分选效率)。质谱流式细胞仪推荐的主要性能参数包括质量范围、质量准确性、质量稳定性、质量分辨率、质量检测限、气动上样器流速、6.1.3综合选型因素除核心性能外，还需综合考量系统自动化与软件易用性、预算、共识9:根据检测项目的技术要求与临床需求，建议科学配置相细胞亚群精细分型等项目，推荐选用三激光8检测通道及以上仪器，并确保仪器的分辨率和灵敏度满足对稀有细胞及弱表达抗原的识别。单激光仪器，并严格执行清洗维护流程。(C级，中推荐)6.2流式细胞仪的使用6.3流式细胞仪的质量监控措施为确保流式细胞仪持续处于最佳工作状态，实验室必须建立并执行一套完整的、周期性的质量监控程序。6.3.1仪器质控荧光流式细胞仪(分析型)在开机当天检测样本前，应使用标准运行，观察液滴充电和偏转的准确性，确保目标细胞能被正确收集。6.3.2年度校准所有类型的流式细胞仪每年至少进行一次仪器校准，校准参数应按照《流式细胞仪校准规范》(JJF1665-2017)中的要求，至少应包含仪器的分辨力、线性相关系数、检出限、漂移、重复性、示值误差等。流式细胞分选仪和质谱流式细胞仪的年度校准应包含仪器的关键参数，合格后方可继续使用。6.3.3其他校准时机在仪器搬移后、经历重大维修(如更换激光器、光纤、光电倍增管、流动室等关键部件)后、重大维护保养后、软件系统进行更新后、仪器性能出现异常或使用环境严重失控时，需重新评估仪器性能。评估应包括仪器性能指标的验证及临床样本检测结果的比对。共识10:流式细胞仪须建立覆盖全生命周期的质量管理程序：6.4样本前处理系统的配置及使用 式细胞仪的相关要求，通常应不高于0.5%。共识11:启用样本前处理系统前，应进行性能验证，参数应包含准确度、精密度、携带污染率等。(A级，强推荐)6.5其他设备的配置及使用样本前处理过程中涉及的关键仪器设备(包括计量器具、辅助设备等)要定期检定、校准、验证。移液器、容量瓶等器具设备应制定七7.1试剂的选择和制备7.1.1检测方案的设计采用差异化的检测方案。(1)商品化预混合试剂方案：对于T淋巴式细胞术抗体组合进行修改时(如单个抗体的替换；或向开放通道中添加1~2个抗体；或任何需要调整电压、补偿等仪器设置参数),可参考《流式细胞术检测方法的修改：基于CLSIH62指南的方法验证交叉反应性的抗体克隆，并同时选用替代标志物(如在抗CD20治疗时，使用CD19进行B细胞检测)。共识12:应优先选用经国家药品监督管理局批准的商品化预混准操作规程。(B级，强推荐)7.1.2荧光素的选择应遵循以下核心原则。(1)仪器匹配性：荧光素的激发光谱必须与围。(2)抗原表达量与荧光素搭配：遵循“强抗原配弱染料，弱抗原，应使用较暗的荧光素。例如，低表达抗原(如CD25)宜选用高亮度荧光素(如PE、APC),而高表达抗原(如CD4)可选用FITC等响小的荧光染料，弱表达抗原选择受影响小的通道。(3)光谱重叠需要正确调节补偿。(4)背景干扰控制：选择荧光素需考虑细胞自发荧光(尤其在蓝紫激光激发下)及抗体非特异性结合带来的背景干扰，宜选择信噪比高的荧光染料。见表2。表2常见荧光素与激光波长、检测通道匹配对照及选择指引激光/nm适用近E表达水活主要检测通道/激光/nm适用近E表达水活中等中一高表达ECD/PE-TexasRedPE-强较宽，易溢漏至其他通道。ECD:早期串联染料，稳定性较差，易淬灭：PE-TexasRed:量子产率尚可，但光稳定性不如PE-CF594,易发生降解；PE-CF594:光稳定性好，批间差小，该通道的首选。强中一弱表达对光敏感，稳定性一般。串联染料，亮度高，但需注意其降解可能增加PE通道背景。强抗原优选。APC-Cy7/APC-H7/APC-A强中一弱表达串联染料，亮度高，注意其降解强区优选染料。中等中一高表达强中一弱表达重要选择。BV786VioletFluor785/QB强中一弱表达质谱流式细胞仪使用非放射性同位素标记的流式抗体，无自发荧光和荧光通道串扰问题，可以同时检测更多指标。同位素的选择推荐强表达抗原配弱信号同位素，弱表达抗原配强信号同位素。7.1.3抗体滴定7.1.4预混合抗体S/N)或平均荧光强度(meanfluo供的标准：每种阳性标记物的MFI应在0.5~1.0个log差异范围内，信号噪声比应在10%~15%差异范围内，阳性细胞比例的差异应在差异在10%~15%,或CV<20%;MFI,在0.5~1个log差异或相同的log范围内；S/N,在10%~15%差异范围内。共识13:自行预混合试剂需评估预混合抗体与单独添加抗体时的检测结果一致性，以及预混合抗体的稳定性。在新配制预混合试剂使用前应进行新旧批次间的比对，并达到可接受标准。(B级，强推7.1.5绝对计数试剂的选择表3)。实验室应根据具体检测项目的需求、样本类型、仪器性能及质量控制要求，选择最适宜的方法与试剂形式。流式细胞仪测得细胞亚群占淋巴细胞的百分数×血细胞分析仪测得的淋巴细胞绝对数。依赖流式细胞仪的精确进积直接计算目标细胞的实际个数或浓度。在一定体积样本中加入一定体积已知浓度的计数标准微球溶液，根据目标细胞与微球数量间的比例关系计算。己知数量计数标准微球干粉的专用绝对计数管，计算过程同液体微球法。无需计数微球，成本低。无需计数微球，操作简便，成本低。结果稳定，准确性好。操作简便，人为误差小，批间差异小，重复性和准确性优于其他方法。用于淋巴细胞分群不佳的样本。理过程中的加样准确性要求极高。每次使用前必须充分混匀微球，否则会影响计数准确性。试剂成本相对较高。流式细胞仪。式细胞仪。细胞仪。7.1.6溶血素的选择自行配制(如氯化铵低渗缓冲液),必须在正式使用前与配套溶血素分数的CV≤15%,或符合实验室内部制定的可接受标准。对于CD347.1.7固定剂和破膜剂的选择在进行细胞内抗原如髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、Ki-67蛋白(Ki-67protein量，应尽量使用与流式抗体配套的专用固定/破膜试剂盒。不同品牌对验证，根据实际染色效果(如信噪比、阳性群与阴性群分离度、分群清晰度等)择优