羔羊腹泻防治技术规程

2本文件确立了羔羊腹泻防治的程序，规定了羔羊腹泻的临床诊断、实验室诊断、预防和治疗的操下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适动物球虫病诊断技术羊寄生虫病防治技术规范畜禽粪便无害化处理技术规范GB/T41441.2规模化畜禽场良好生产环境第2部分：畜禽舍技术要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T4144动物源细菌抗菌药物敏感性测试技术规程纸片扩散法出生后至3月龄的绵羊及山羊。由细菌、病毒、寄生虫等病原微生物感染或其他因素(环境或日粮等因素的改变诱导胃肠道功能失衡)引起的一种以腹泻、脱水、粪便性状改变等为主要特征的消化道疾病，根据病因分为感染性腹阈值循环数cyclethreshold,Ct值在实时荧光定量PCR中，每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时的循环数。Ct值根据某种微生物特殊的营养要求或对某些特殊化学、物理因素的抗性而设计的，能选择性区分微生物的培养基，可使混合菌群中的某种微生物变成优势种群，从而提高该种微生物的筛选效率。4防治技术程序羔羊腹泻防治技术程序见图1。日常饲养管理物安全管理母羊管理对症治疗对因治疗¥羊管理图1羔羊腹泻防治流程图5诊断5.1流行特点4羔羊腹泻多在产羔季节发生，冬春季较多发，…般在羔羊出生后7d～5.2.1感染性腹泻5.2.1.1细菌性腹泻5.2.1.1.2最急性型病例发病急骤，体温40℃~41℃,精神沉郁、食欲废绝，排黄色或灰黄色液状或半液状稀粪，含气泡与粘液，部分带血，24h内衰竭死亡。5.2.1.1.3急性型病例体温40℃~41℃,精神沉郁、食欲废绝，排黄色或灰黄色液状稀粪，混有5.2.1.1.4慢性型病例病程可持续1周至1个月，主要表现为持续性腹泻，粪便呈水样或稀糊状，精5.2.1.2病毒性腹泻5.2.1.2.1引起羔羊腹泻的主要病毒为小反刍兽疫病毒，小反刍兽疫是国家一类动物疫病，传染性极5.2.1.2.2急性病例常在发病后5d～10d内死亡。病初体温骤然升高至40℃~41℃,精神沉郁、食欲废绝，眼鼻流浆液性分泌物后变浓稠。鼻镜干燥，继而出现坏死性、化脓性肺炎症状，呼吸急促、咳嗽。病羊后期发生严重腹泻、排出的水样粪5.2.1.2.3慢性病例病程较长，主要表现为肺炎与持续性腹泻交替出现、病羊极度消瘦、脱水，最终5.2.1.3寄生虫性腹泻5.2.1.3.1引起羔羊腹泻的主要寄5.2.1.3.2临床表现为精神沉郁、嗜睡、被毛粗乱、食欲下降乃至废绝。特征性症状为腹泻、初期排稀便、后期发展为带血的水样稀便或纯血便、具恶臭味。伴随症状包括不同程度的脱水、发热、体质5.2.2非感染性腹泻5.2.2.2通常表现为群发性的水样或糊状腹泻、粪便颜色多为黄色或灰白色、肛门及后躯常被稀粪污染、同时伴有精神萎靡、食欲减退等全身症状。若持续腹泻，会出现脱水、消瘦等表现。此类腹泻具5.3病理变化5.3.1感染性腹泻5.3.1.1细菌性腹泻55.3.1.1.1最急性与急性病例常见肠壁充血或出血、肠系膜淋巴结肿大、真胃及肠道内容物呈灰黄色5.3.1.1.2慢性病例则可见胃肠道出血性炎症、有未消化的凝乳块、肠系膜淋巴结肿大，部分病例继5.3.1.2病毒性腹泻5.3.1.2.1急性病例以消化道黏膜糜烂、溃疡，气管出血、内有泡沫，肺尖叶呈现肉样变，直肠、真5.3.1.2.2慢性病例则在5.3.1.2.1基础上，并发大叶性肺炎或支气管肺炎、可见肺肝变及胸腔纤维5.3.1.3寄生虫性腹泻5.3.1.3.1肠道浆膜和黏膜表面可见大量从粟粒至豌豆大小的淡黄色、褐色或白色斑块或坏死灶、肠壁广泛充血、出血，肠腔内充满混杂脱落黏5.3.1.3.2组织学变化主要表现为绒毛萎缩、微绒毛变短及肠细胞脱落。5.3.2非感染性腹泻死亡羔羊剖检无明显特征性、器质性病变。主要可见肠道内容物稀薄、肠壁变薄、水肿、肠黏膜可能呈卡他性炎症变化(表现为黏膜充血、表面附着大量黏液),其余实质器官无明显病变。5.4结果判定羔羊出现5.2.1、5.3.1中部分或全部临床症状和病理变化时，可初步判定为感染性腹泻疑似病例，确诊应按NY/T541的规定采集样品进行实验室诊断。5.5.1.1按NY/T541方法采集、保存和运输样品。活羊宜采集直肠内粪便或肛拭子，粪便样品应选新鲜粪便至少20.0g,使用无菌容器运送。肛拭子样品应取无菌棉拭子插入肛门中，旋转5圈～105.5.1.2病死羊解剖后无菌采集肠、肠系膜淋巴结、肠道内容物，编号并记录病料来源等相关信息。5.5.1.34℃以下保存和运输粪便样品，24h内送达实验室进行检测。5.5.1.4若无法立即检测，供细菌检验的样品应于2℃~8℃保存，供病毒检验的样品应在一20℃5.5.2细菌性腹泻诊断5.5.2.1仪器设备5.5.2.2试剂65.5.2.3细菌分离培养5.5.2.3.1预增菌将样品用无菌接种环接种于马丁肉汤液体培养基，震荡摇床中37℃培养12h～18h。5.5.2.3.2.3血琼脂平板倒置于37℃恒温培养箱内，培养24h～48h后观察。5.5.2.4细菌革兰氏染色镜检根据附录B挑取典型单菌落制片，按革兰氏染色试剂盒具体操作步骤进行染色，染色结束后使用普通光学显微镜观察，不同细菌的镜检结果见附录B中表B.1。5.5.2.5实时荧光定量PCR鉴定5.5.2.5.1仪器设备实时荧光定量PCR仪、台式低温高速离心机、混匀器、冰箱、不同量程可调移液器、生物安全5.5.2.5.3引物序列大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏列详见附录C中表C.1。按照核酸提取试剂盒说明书的要求提取样品中的核酸，如立即检测应将否则将提取的核酸置于-80℃以下保存。每次提取核酸时应至少设置一个阳性对照和阴性对照。5.5.2.5.5核酸扩增每次扩增时，应设立阳性对照、阴性对照及空白对照。阳性对照应用阳性对照样品提取的核酸作为模板，阴性对照应用阴性对照样品提取的核酸作为模板，空白对照应用无核酸酶水作为模板。按附录C中表C.2配制荧光定量PCR反应体系，将PCR扩增管置于PCR仪中，按表C.2扩增条件运行程5.5.2.5.6试验成立条件7阳性对照的Ct值<30且出现特异性扩增曲线，阴性对照无Ct值或阴性对照Ct值≥40且无特异5.5.2.5.7实时荧光定量PCR结果判定表1实时荧光定量PCR结果判定当无Ct值或Ct值≥40当38<Ct值<40且出现特异性扩增曲线，则判为疑似疑似样品，模板量加倍进行1次复检，做3个<40且出现特异性扩增曲线即判为核酸阳性，否则判为核酸阴5.5.4寄生虫性腹泻诊断5.5.4.1球虫诊断5.5.4.1.1试剂饱和盐水，配制方法见附录A。60目和100目铜丝网或尼龙网、100mL量筒、50ml.烧杯、50mL离心管、10mL玻璃瓶、吸5.5.4.1.3粪便虫卵诊断法a)将被检动物或动物群的新鲜粪便充分搅匀后取10g,放入50mL烧杯中，加入适量水；b)轻轻搅匀，经60目铜丝网或尼龙网过滤，滤液再经100目铜丝网或尼龙网过滤；e)用饱和盐水加满玻璃瓶，盖上盖玻片(盖玻片应与液面接触),静置10min;f)取下盖玻片，将有液体的一面盖在载玻片上；g)置载玻片于显微镜载物台上，用10×10或10×40的倍数进行检查；h)粪便虫卵诊断结果(形态见附录D中图D.1):球虫卵囊：椭圆形或圆形，8μm～30um。85.5.4.2隐孢子虫诊断5.6综合判定5.6.1疑似感染患病羔羊出现5.2部分或全部临床症状，死亡羔羊出现5.2、5.3部分或全部临床症状及病理变化符合5.2临床症状、5.3病理变化，并满足5.5实验室诊断结果为阳性的样品，判定为确诊病6预防科学搭配日粮，母羊生产前2个月补足精料、蛋白质，适量增加矿物质和维生素，确保母羊营养6.1.2合理分群6.1.3产房环境卫生产房面积按每只待产母羊2m²~3m²配置，冬季温度不低于15℃。产前对圈舍、地面、器具彻确保羔羊出生后1h内摄入初乳。6.2.3保温措施环境温度保持在15℃~22℃,干燥无风。6.2.4疫苗免疫9疾病类别疫苗类别大肠杆菌羊大肠杆菌病灭活疫苗免疫方式、免疫时间和免疫剂量参考疫苗说明书羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗羊快疫、猝组、羔羊痢疾、肠毒血症四联干粉灭活疫苗羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症、黑疫、肉毒梭菌中毒症六联干粉灭活疫苗小反刍兽疫小反刍兽疫活疫苗小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗6.3日常饲养与环境管理6.3.1清洁与消毒6.3.1.1按GB/T41441.2的要求，加强环境清洁、粪便清理、卫生消毒等卫生防疫措施，常用消毒药见附录E中表E.1。6.3.1.2及时清理产房和羔羊圈的粪便、潮湿垫草，定期更换垫草，保持地面干燥。食槽、水槽、奶6.3.3补饲与补硒缺乏症，可在此阶段肌注补硒制剂(如亚硒酸钠注射液等),常用量为1mL～2mL,应按药品说明书6.3.4减少应激6.3.4.1外部环境因素变化，如控制噪音低于60分贝，避免突然声响；羔羊适宜温度为15℃~25℃,出生1周内尤其敏感；湿度控制在40%～60%。6.3.4.2饲养管理因素变化，如饲养密度每只羔羊不少于1.5m²~2.0m²,按时分群，每群数量控制在20只～30只：换料过渡期7d～10d,新旧混合，逐步替换。6.3.5.2定期称重，每周称重1次，记录生长速度。6.4.1人员防护为防止人兽共患病对饲养人员、兽医等防疫人员的危害，相关从业人员在操作时应佩戴口罩、手6.4.2疫情应急处置发生疑似重大动物疫病时，应按要求立即向所在地农业农村主管部门报告，并采取隔离等防控措6.4.3灭鼠灭虫定期投放灭鼠药、安装防鼠设施，定期灭虫，防6.4.4粪便无害化处理按GB/T36195要求对粪便进行无害化处理。6.4.5病死羔羊处理应遵守《病死及病害动物无害化处理技术规范》中的规定，病死羔羊应优先采用深埋法或焚烧法7.1治疗原则7.2.1抗生素药物7.2.1.1常用参考药物见附录E中表E.2。条件允许的应按NY/T4144要求开展药敏试验，按照试验常用参考药物见附录E中表E.2。应遵守《畜禽标识和养殖档案管理办法》中的规定，建立流程可追溯性档案，档案包含羔羊腹泻的临床诊断、实验室诊断、预防和治疗等操作指示的记录，如羔羊体温监测记录、羔羊免疫记录、羔羊圈舍消杀记录、羔羊圈舍温湿度记录、患病羔羊治疗记录等，档案保存期为10年。(资料性)称取蛋白胨20.0g、乳糖10.0g、牛胆盐5.0g、氯化钠5.0g、中性红0.03g、结晶紫0.001称取胰蛋白胨15.0g、大豆胨5.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g,加纯化水至1000mL,充分混合，加热煮沸至完全溶解，将培养基放至室温，分装，121℃高压灭菌15min,冷却至45℃~A.3TSC琼脂平板(基础)称取蛋白胨15.0g、酵母浸粉5.0g、葡萄糖5.0g、硫乙醇酸钠1.0g、柠檬酸铁铵0.5g、琼脂15.0g,加纯化水至1000mL,充分混合，加热煮沸至完全溶解，将培养基放至室温，分装，121℃高压灭菌15min,冷却至45℃~50℃时，加入0.5g过滤除菌的D-环丝氨酸溶液，混匀后称取蛋白胨5.0g、牛肉浸粉3.0g、磷酸二氢钾0.4g、硫酸镁0.1g、葡萄糖2.0g、孟加拉A.5饱和盐水配制称取400g食盐，放入烧瓶中，加1000mL水，加热烧瓶至沸腾，充分搅拌后冷却至室温，有少(资料性)大肠杆菌马丁肉汤液的直杆菌、多单个散在排列钝圆的粗大杆菌、多单个或成双排列多杀性巴氏杆菌血琼脂平板上呈细小、湿润、透明的露滴状菌落、不溶血状或短杆状、两端钝圆溶血性曼氏杆菌血琼脂平板上呈细小、湿润、透明的露滴状菌落、α溶血(窄溶血环)(资料性)检测病种检测靶基因引物及探针序列(5'→3')大肠杆菌Probe:CY5-TTCGCCTCATTAACCTATGGATTCAGProbe:FAM-CCTTTCCGCTATCGGTAAProbe:FAM-CCTGCTAATGTTACTGCCGTTGATAGCG多杀性巴氏杆菌Probe:FAM-TCCCCATCTCGTCGAAAATTGATTGTC溶血性曼氏杆菌Probe:FAM-CCCAACGTGTTGCAGCAGGTTTATCTT表C.2荧光定量PCR反应体系及反应条件体积(μL)荧光PCR预混液(2x)95℃预变性5min;表C.1中对应温度退火延伸30s;2总体积(资料性)羊球虫虫卵图片A:克氏艾美耳球虫；B:阿普艾美耳球虫；C:图D.1羊球虫孢子化卵囊形态图(资料