蛋白表达纯化专题方法技术课件

蛋白纯化技术专题蛋白表达纯化专题方法技术表达系统·亲和纯化·层析技术·流程优化2026年课程导览01表达系统全景原核与真核表达体系整体认知02原核表达系统大肠杆菌与芽孢杆菌体系详解03真核表达系统酵母、哺乳动物与昆虫体系详解04亲和纯化技术标签设计与金属螯合层析原理05层析纯化方法凝胶过滤、离子交换与疏水层析06流程与展望纯化流程落地与产业应用前景表达系统全景选对系统，事半功倍从宿主到载体，构建表达系统整体框架01蛋白表达系统构成宿主、外源基因、载体与辅助成分，四位一体宿主蛋白表达的承载主体，为外源基因提供转录、翻译及折叠所需的完整细胞机器。宿主的选择直接影响目的蛋白的表达量与修饰方式。外源基因目标蛋白的编码来源，决定了表达产物的氨基酸序列与生物学功能。其密码子偏好与宿主适配度影响翻译效率。载体介导基因进入宿主，须与宿主匹配，适配原核、酵母、昆虫、哺乳动物等不同体系。决定启动子强度、拷贝数与筛选标记，是表达效率的核心工具。辅助成分部分系统必需，如昆虫表达体系中的杆状病毒。辅助元件共同保障感染与表达的顺畅进行。表达系统如何分类按宿主划分的两大阵营原核表达系统原核代表性宿主：大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌，是应用最广泛的蛋白表达宿主类型。真核表达系统真核代表性宿主：酵母、昆虫、哺乳动物、植物细胞，适合复杂蛋白的翻译后修饰。原核表达系统高效经济的表达主力大肠杆菌与芽孢杆菌的优劣与应用02大肠杆菌系统核心优势最早采用、掌握最成熟的表达系统目前生产重组蛋白最常用的系统常用表达菌株常用表达菌株为

BL21

系列，配套

pET

表达系统评估周期评估重组基因表达不到

1周

即可完成遗传背景清楚、繁殖快、成本低、稳定性好表达性能表达量高、抗污染能力强系统地位是目前生产重组蛋白最常用的系统IPTG如何打开表达开关lac操纵子调控机制基因开关平时阻遏蛋白锁死基因表达，处于

关闭

状态。加入

IPTG

后解除阻遏，激活目标蛋白表达。IPTG稳定耐造，可

持续激活

表达。诱导表达的价值表达调控可

人为控制表达的启动时机。便于先积累菌体、再集中表达目标蛋白。宿主菌株怎么选需求场景优选菌株核心优势常规非毒性蛋白BL21通用经济pET系列表达BL21(DE3)整合T7RNA聚合酶极低本底表达BL21AI/Lemo21动态调控聚合酶活性毒性蛋白表达C41/C43突变耐受可溶性蛋白生产Origami/Rosetta氧化还原优化高严谨性筛选M15pREP4抑制本底泄露可溶性表达优化要点控制翻译速度是提升可溶性表达的关键三项并列策略翻译速率调控低温诱导：降低温度至

16-20℃

诱导，放慢转录翻译速率，利于正确折叠低浓度IPTG：采用低浓度

IPTG

诱导降低蛋白酶活性：低温还可降低

热休克蛋白酶活性辅助策略协同优化分子伴侣共表达：与分子伴侣共表达促进可溶性蛋白特异性验证：该方法具蛋白特异性，需逐一如实验证包涵体的两面性大肠杆菌翻译折叠速率比真核细胞高近10倍，真核来源蛋白易错误折叠聚集弊端妨碍获得可溶的活性蛋白需变性复性才能恢复活性益处不易被蛋白酶降解易于离心浓缩，杂蛋白污染少表达载体与调控元件非融合型接近天然蛋白，保持天然构象易被蛋白酶破坏、难纯化融合型易分离纯化，便于后续操作融合部分可能影响结构，需去除启动子选用

lac、trp、λPL、Tac

等强启动子，驱动高水平转录。SD序列与起始密码子间距直接影响翻译效率。终止子负责控制转录终止，保障表达进程有序结束。芽孢杆菌表达系统核心优势3项革兰氏阳性菌单层膜结构、分泌系统完善直接分泌外源蛋白可直接分泌到培养基，不易形成包涵体安全认证获FDAGRAS

认证与欧洲QPS认证，不产生内毒素表达水平1项高表达常用pHT01质粒含

Pgrac强启动子，目标蛋白可占细胞总蛋白16–30%总蛋白占比16-30%局限性2项工具较少遗传操作工具较少蛋白降解蛋白易被宿主蛋白酶降解真核表达系统复杂蛋白的正确折叠之道酵母、哺乳动物与昆虫体系解析03酵母系统的定位与菌株兼具原核低成本与真核修饰能力宿主菌株是酵母系统定位的第一环：食品安全级与遗传操作成熟决定了从科研到工业的可用性。主流宿主菌株酿酒酵母→毕赤酵母→其他候选酿酒酵母→毕赤酵母→其他酿酒酵母：经典菌株，食品安全级，遗传操作成熟；局限：糖基化为高甘露糖型，易引发免疫原性毕赤酵母：甲醇诱导型，当前科研与工业最主流其他：多形汉逊酵母、乳酸克鲁维酵母毕赤酵母表达策略启关键启动子AOX1甲醇强诱导启动子，严谨可控GAP甘油组成型持续表达表信号肽与表达模式α-交配因子信号肽引导蛋白分泌至胞外胞内表达适合膜蛋白、包涵体蛋白分泌表达杂蛋白背景低、纯化简便，最常用毕赤酵母可高密度发酵，表达量可达

克每升

级酵母优势与糖基化工程酵母真核修饰，锚定高保真表达平台完整真核翻译后修饰能力5项正确折叠二硫键配对O糖基化、N糖基化信号肽切除磷酸化修饰生物安全性高2项细胞壁不含脂多糖内毒素纯化后无需复杂去内毒素工艺哺乳动物细胞表达系统系统构成4项宿主细胞以

CHO、HEK293

等细胞为宿主表达载体通过转染导入表达载体强启动子使用

CMV、SV40

等强启动子信号肽加信号肽促使蛋白分泌核心优势3项天然状态最接近蛋白天然状态生物活性生物活性与稳定性更高复合物组装能组装复杂蛋白质复合物应用与瓶颈2项应用方向用于功能研究、疾病机制、药物靶点、抗原制备主要瓶颈瓶颈是表达量低、培养复杂昆虫杆状病毒表达系统作为真核表达平台的重要补充，适合需要一定修饰但不能用哺乳动物细胞的场景昆虫体系，真核平台的重要补充系统机制利用多角体蛋白启动子实现高效表达杆状病毒作为辅助成分，协助载体进入宿主细胞加工能力可完成二硫键形成等翻译后加工亲和纯化技术标签为引，精准捕获His标签与Ni柱亲和纯化原理04His标签与IMAC原理标签为引，精准捕获目标蛋白1结合机制重组蛋白N端或C端添加

6×His

标签组氨酸咪唑基团与

Ni²⁺

形成配位键，特异性吸附2固定方式Ni²⁺

通过

NTA

或

IDA

螯合剂固定在层析介质表面Ni²⁺

共

6

个配位键，部分裸露与咪唑基团结合3洗脱高浓度咪唑竞争结合镍离子，破坏配位作用释放目标蛋白螯合配体类型对比配体类型配位特点结合能力主要特点Ni-IDA三齿配位强结合力强，易泄漏Ni-NTA四齿配位较强稳定性高，常用Ni-TED强螯合弱显著低于前两者Ni-IDA

与

Ni-NTA

为最常用两类，选用需参考填料说明书咪唑梯度洗脱策略上样结合缓冲液平衡后上样His标签蛋白吸附在柱上平衡上样洗杂低浓度咪唑5-20mM洗去弱结合杂蛋白5-20mM洗脱高浓度咪唑100-500mM竞争洗脱目标蛋白100-500mM亲和纯化条件优化His标签结合专一性强，纯度可达95%以上，1-2小时即可完成快速捕获pH控制pH7-8

时组氨酸咪唑基团去质子化，利于结合pH低于

6

会显著降低结合力离子强度高盐如

500mMNaCl

可减少非特异性吸附低盐浓度

20-50mMNaCl

亦可减少非特异吸附亲和纯化常见问题聚焦关键参数，解决高频纯化故障蛋白不结合检查His标签是否完整，优化表达条件如降低诱导温度结合弱可改用结合力更强的钴柱洗脱纯度低提高洗涤步骤咪唑浓度至

10-40mM使用含竞争剂的洗涤液去除疏水杂质镍柱再生与保存用盐酸胍或EDTA

去除残留蛋白，再重新负载金属离子长期保存置于

20%乙醇

中防污染其他亲和标签可溶性融合标签GSTMBPNusA硫氧还蛋白SUMOGST与MBP

兼作亲和纯化标签GST

可用谷胱甘肽琼脂糖亲和纯化，再用凝血酶或因子Xa切开标签移除01在标签与目标蛋白间插入蛋白酶酶切位点02用特异性蛋白酶切除03移除后蛋白可能变得不可溶，须谨慎测试层析纯化方法按性质分离，逐级提纯凝胶过滤、离子交换与疏水层析05六大层析方法概览按性质分离，逐级提纯亲和层析特异性亲和力高选择性依据特异性亲和力分离凝胶过滤层析分子大小尺寸排阻依据分子大小分离离子交换层析表面电荷电荷差异依据表面电荷分离疏水层析疏水相互作用疏水差异依据疏水相互作用分离凝胶过滤层析依据分子大小差异分离，大分子蛋白先洗脱；分子越小，进入孔径越深，越晚洗脱技术特点2项可纯化分子量范围宽不需引起蛋白变性的有机溶剂使用注意与优化2项电荷密度高的蛋白易吸附树脂有轻度亲水性，不适宜纯化层析柱越细、越长纯化效果越好离子交换层析洗脱机制适用适用于具有不同

等电点

的蛋白质分离分离原理2项依据蛋白

表面电荷量

差异分离蛋白与阳离子或阴离子交换柱结合第1步可逆结合结合作用

可逆蛋白与交换柱的结合可被温和条件解除，为后续洗脱提供基础。第2步改变条件改变pH或逐渐增加离子强度调节缓冲液条件，促使结合蛋白逐步脱离交换柱。第3步顺序洗脱不同物质电荷不同，洗脱顺序不同结合能力强弱决定各蛋白先后被洗脱的次序。疏水相互作用层析利用疏水基团进行蛋白分离，方法简单有效分离原理2项利用疏水基团分离基于蛋白疏水性质实现分离，简单有效离子排斥促进疏水结合缓冲液中的离子排斥带电分子，促进疏水结合典型应用3项中间纯化步骤用于中间纯化环节去除宿主细胞污染物去除部分纯化靶标中的宿主细胞污染物HIC树脂纯化ZsGreen高盐上样、降盐洗脱实现分离亲和层析的广义分类配基概念与核心优势配基是起可逆结合的特异性物质可为酶底物、抑制剂、辅因子、特异性抗体分离效果好、条件温和、结合效率高、速度快适用于杂质远大于目标物的复杂混合体系基团亲和层析一种配基吸附多种蛋白三嗪染料纯化糖蛋白高选择性亲和层析一种配基只吸附一种蛋白单克隆抗体吸附抗原流程与展望从实验室到产业化纯化流程落地与市场应用前景06两阶段纯化框架从粗到精，逐级逼近高纯度粗分离→精细纯化，逐级逼近目标蛋白逐级逼近纯度先分离细胞成分，再区分理化性质接近的蛋白粗分离阶段目的将目的蛋白与RNA、DNA等细胞成分分开常用方法硫酸铵沉淀法精细纯化阶段目的把目的蛋白与大小及理化性质接近的蛋白区分开常用方法凝胶过滤、离子交换、疏水、亲和层析原核表达纯化流程步骤1表达细菌培养与诱导表达菌株培养至适宜密度，加入诱导剂启动目标蛋白表达步骤2破碎细胞破碎常用超声波破碎或高压均质，释放胞内蛋白步骤3收集包涵体收集离心分离可溶性与包涵体组分步骤4溶解变性溶解使用尿素、盐酸胍溶解包涵体步骤5复性复性处理透析或稀释使蛋白复性，恢复天然构象步骤6纯化亲和层析利用His标签进一步纯化步骤7检测质量检测SDS等方法评估纯度与产量真核表达纯化流程标准流程常用方法第1步细胞裂解破碎细胞释放目标蛋白通过物理或化学方式破碎细胞，使目标蛋白游离至溶液中。第2步粗提离心去除细胞碎片与大分子杂质离心沉淀细胞碎片与大分子杂质，收集含目标蛋白的上清液。第3步纯化根据蛋白性质选择合适方法依据目标蛋白的理化特性，选择亲和、离子交换或分子筛等方法。第4步透析或浓缩去除杂质与小分子调整浓度通过透析或浓缩去除小分子杂质，并将样品调整至目标浓度。第5步质量检测检测纯度与生物活性对终产物进行纯度与生物活性检测，确认符合质量标准。亲和层析标签特异性捕获离子交换层析电荷差异分离分子筛层析分子大