细胞培养技术标准化实验指引课件

LABPROTOCOL细胞培养技术标准化实验指引无菌·配制·传代·质控2026年课程导览01无菌操作与安全筑基建立无菌意识，明确生物安全等级02培养基配制规范拆解基础液与完全培养基配制流程03细胞传代标准流程贯通消化、终止、离心、分装全链条04质量控制与污染防控聚焦支原体检测与防控策略05实验室管理与长效保障落实制度规范与生物安全动态CHAPTER无菌操作与安全筑基无菌是细胞培养的第一道生命线从环境消毒到个人防护，筑牢操作根基01无毒无菌是培养首要条件细胞在体外失去机体免疫系统的保护，缺乏对微生物的防御能力，因此无毒无菌是细胞培养的第一前提。三大类污染特征与危害对照污染类型典型特征危害表现支原体无致死毒性，体积小不易鉴别与细胞长期共存，潜在影响实验结果细菌增殖快，短时间大量扩增产生毒素迅速杀死细胞真菌种类繁多，肉眼可见漂浮于培养液面，污染扩散缺一不可无菌工作区域、良好个人卫生、无菌试剂与无菌操作生物安全等级划分认知生物安全法规将防护水平划分为四个逐级升高的等级，明确了对应的微生物学准则、安全设备与设施措施。自上而下01BSL-1适用于已明确鉴定、不会引起健康人疾病的活性微生物，为基础防护等级。02BSL-2适用于经摄入或经皮、粘膜暴露可致中等风险疾病的物质。03BSL-3适用于可能经气溶胶传播、可致严重甚至致命感染的物质。04BSL-4适用于经传染性气溶胶传播、可致危及生命不治之症的外来物质。大多数细胞培养实验室应至少达到

BSL-2

等级，具体要求取决于所用细胞系与工作类型。消毒灭菌方法参数对照不同物品需匹配相应的灭菌方法，参数执行到位才能彻底杀灭微生物。方法关键参数适用对象高压蒸汽灭菌121℃、0.1MPa

维持15至30分钟培养基、溶液、玻璃器皿、工作服干热灭菌160至170℃

维持1至2小时玻璃器皿、金属器械过滤除菌0.22微米微孔滤膜血清、抗生素等热不稳定液体化学消毒75%乙醇、新洁尔灭、甲醛熏蒸皮肤、器械表面、空间高压蒸汽灭菌可杀灭包括细菌芽孢在内的所有微生物，是最常用、最有效的方法。环境消毒与柜内操作规范环境消毒频次超净工作台使用前紫外线照射消毒

30分钟以上细胞培养室每日工作前紫外线照射

1小时，实验前后超净台照射

30分钟无菌室每周新洁尔灭加紫外线消毒

1至2次，每两周彻底清理消毒

1次安全柜内操作消毒操作前用

70%乙醇

消毒安全柜，喷洒手套后风干

30秒

再操作设备擦拭所有进入柜内的设备用浸有

70%乙醇

的纸巾擦拭动作规范柜内及周边移动

缓慢，避免扰乱气流；说话、喷嚏、咳嗽须远离柜口个人防护与废弃物处置个人防护装备6项手套穿戴到位，污染立即更换实验服或隔离衣在人员与危险品之间形成直接屏障鞋套防止污染扩散呼吸器过滤有害气溶胶面罩保护面部护目镜防溅射损伤始终穿戴污染即换操作危害物质后及离开实验室前洗手废弃物与纪律10,000ppm液体细胞培养废物丢入次氯酸钠，柜内保存至少2小时（最好过夜）后冲入下水道禁食实验室内不得进食、饮水、吸烟、处理隐形眼镜或存放食物即擦实验开始前、结束后及发生泼溅时，立即对工作台面去污CHAPTER培养基配制规范配方精确，是细胞生长的营养保障从基础液到完全培养基的完整配制链02培养基组成与营养功能细胞培养基是人工配制的营养溶液，通过提供氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐等必需成分支持细胞体外生长。自1951年首个合成培养基MEM问世以来，培养基逐步向

无血清、化学成分限定

方向发展。基础培养液血清或替代物生长因子及缓冲系统平衡盐水Hanks液和Earle液维持渗透压与离子平衡pH调整液碳酸氢钠溶液及HEPES溶液调节和稳定pH值细胞消化液胰蛋白酶、EDTA、胶原酶溶液解离贴壁细胞抗生素溶液青霉素-链霉素混合液每毫升含

100单位青霉素和

100微克链霉素培养基关键指标与储存条件培养基的理化指标直接决定细胞能否正常代谢。指标标准范围血清溶解温度切勿超过37℃，需轻摇混匀血清储存温度-20℃或更低可储存30天以上，通常存储于-70℃血清储存方式建议分装储存，避免反复解冻影响活性血清储存要点血清溶解时切勿超过37℃且需轻摇混匀，40℃以上水浴且不混匀会导致瓶内出现沉淀物。血清在-20℃或更低温度可储存30天以上，通常存储于-70℃。建议将血清分装储存，避免反复解冻影响活性。基础培养基配制标准流程以RPMI1640为例，基础培养基配制须严格遵循以下流程：1制备蒸馏水若放置过久须经高压灭菌处理，水温降至

15至30℃

时加入合成培养基干粉›2溶解干粉磁力搅拌使干粉充分溶解，通入适量

二氧化碳

促进溶解›3pH调节加入试剂将pH调至约

6.0

促进成分溶解，再加碳酸氢钠调至近中性›4定容过滤分装定容后过滤除菌，分装至无菌玻璃瓶并于

4℃

保存关键提示培养液过滤后pH会

升高0.2至0.3，过滤前调至6.9左右，过滤后恰好达到细胞生长适宜的

7.1至7.2过滤时过滤泵压力不宜过高，以免

滤膜破裂

失去除菌功效分装按

3至5天

用量，每瓶仅装三分之一体积液体完全培养基配制比例与时效完全培养基由基础培养基与补充剂按固定比例配制，操作须在生物安全柜内完成。培养基类型配制比例使用时限复苏培养基使用前

37℃

水浴预热

20至30分钟开封后一次性用完铺板完全培养基250毫升

基础液加

15毫升

补充剂72小时内用完维持完全培养基500毫升

基础液加

5毫升

补充剂建议现配现用，最长

72小时补充剂分装冻存补充剂首次开封后建议按需分装后于

-20℃

冻存，避免反复冻融。过滤除菌需要过滤除菌时选用

0.2微米

无菌滤器。缓冲液配方与器具管理平衡盐溶液是清洗细胞、维持渗透压的常用试剂，配制须精确称量。PBS溶液配制1准确称量磷酸二氢钾

0.27克、磷酸氢二钠

1.42克氯化钠

8克、氯化钾

0.2克›2溶解调pH加超纯水至

1000毫升，搅拌至充分溶解逐滴加入盐酸或氢氧化钠调节pH›3高温灭菌于

121℃

灭菌

30分钟›4冷却保存过夜冷却后放入

4℃

冰箱保存器具管理提醒培养细胞的器具必须与提取RNA、培养细菌的器具严格区分。提取RNA所用的

0.2%DEPC

具有致癌性，还会对细胞生长产生影响。CHAPTER细胞传代标准流程细节决定细胞活性与实验成败消化、终止、离心、分装，环环相扣03传代时机判断与前准备细胞传代是细胞培养最基础、最关键的核心操作，严谨的细节决定细胞活性与实验成败。传代时机汇合度达80%至90%为最佳传代时机密度过小影响生长，传代细胞密度不低于5×10⁵每毫升传代前准备培养液、PBS液和胰蛋白酶放入37℃水浴预热用75%酒精擦拭经紫外线照射的超净工作台和双手正确摆放器械，保证足够操作空间，点燃酒精灯并确保火焰充足从培养箱取出细胞时旋紧瓶盖，镜下观察细胞状态胰酶消化关键控制消化是传代最关键的一步，时间必须精准把控。消化是传代最关键的一步，时间必须精准把控操作要严格按流程执行，并随时镜下观察判断消化程度。1清洗PBS吸弃旧培养基充分清洗，洗去残留血清避免影响消化效果2消化0.25%胰蛋白酶消化液量以刚好盖住细胞为宜3温育37℃最佳消化温度37℃，于培养箱内消化适度判断镜下观察细胞胞质回缩、细胞之间不再连接成片即表明消化适度，应立即弃去胰酶并加入培养液终止消化不足细胞难以吹打脱落消化过度损伤细胞膜、影响活性终止消化与吹打分散RAW264.7等巨噬细胞不用胰酶消化，轻轻吹打使其脱落即可终止消化与吹打分散操作要点4项终止终止时机观察细胞变圆、状态与贴壁时明显不同时，立即加入完全培养基终止消化终止终止液用量一般为胰酶的2倍吹打吹打方式用滴管轻柔有序地吹打，利用液体冲击力剥离细胞，避免气泡剪切力损伤细胞膜消化消化时间不同细胞消化时间各异，如巨噬细胞类细胞消化约5分钟、过密时约6分钟离心富集与分装接种离心富集收集细胞悬液至离心管，配平后离心；参数一般为800至1000转每分钟，离心5至8分钟离心低速富集细胞，彻底去除残留胰酶、代谢杂质与废液弃去上清液，加入新鲜培养液，用滴管轻轻吹打制成细胞悬液分装接种将细胞悬液按标准比例分装至2至3个培养瓶，加入适量培养基采用8字混匀法或十字晃板让细胞均匀分布，避免局部扎堆旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭瓶身，放入37℃、5%二氧化碳培养箱继续培养12传代后观察与密度评定培养瓶上应注明细胞名称、传代次数、培养人姓名及培养时间，便于追溯与管理。铺展面积占瓶底比例分级25%一个加号（+）50%两个加号（++）75%三个加号（+++）CHAPTER质量控制与污染防控看不见的污染，最致命的隐患以支原体防控为核心构建质控体系04支原体污染现状数据四类场景污染率横向对比支原体污染全球普遍存在且高度隐蔽污染率关键数据全球细胞培养污染率15%–35%极端实验室污染率65%–80%多菌株混合感染占比7%–60%技术人员口腔携带率80.6%单一污染细胞可在

6周

内感染同一超净台内所有培养物，呈"单点输入、全域扩散"特征。支原体的生物学特性体积小、耐药强、无指征——三重特性叠加，铸就支原体污染的隐蔽性根源支原体的生物学特性决定了其污染的高度隐蔽性01生物学特性体积微小直径约

0.15至0.3微米可穿透常规

0.2微米

除菌滤膜高压差过滤会进一步增强其穿透能力02生物学特性天然耐药无细胞壁结构对青霉素等作用于细胞壁的抗生素

完全耐药细胞膜可与宿主细胞融合，实现胞内定植03生物学特性生长无指征滴度可达

10⁷CFU每毫升

时仍不引起培养基浑浊或pH骤变仅重度污染才出现细胞生长缓慢、颗粒增多等非特异性表现支原体污染的隐蔽危害支原体通过营养竞争、代谢毒性与直接细胞作用，全面干扰实验体系。“支原体污染常于无声中入侵——待察觉时，实验体系已被动摇。”支原体污染的隐蔽性与不可逆损伤，使其成为细胞培养中最需警惕的风险点营养竞争精氨酸被耗竭，直接打击细胞活力消耗培养基中的精氨酸抑制细胞增殖、增加凋亡敏感性导致贴壁细胞脱落代谢毒性与细胞作用分泌核酸酶降解宿主DNA与RNA，引发染色体断裂、易位与基因表达谱改变降低转染效率、抑制病毒增殖，使药物筛选、细胞因子检测等结果失真在生物制药与细胞治疗中，污染会导致整批产品报废，存在临床安全风险支原体检测方法对照单一方法存在局限性，建议至少采用两种方法联合验证。检测方法原理与周期主要特点微生物培养法接种专用培养基，培养28天观察菌落药典金标准，可区分活菌与死菌，周期长荧光DNA染色法DAPI或Hoechst染色，荧光显微镜观察，2至3天对难培养菌株有效，判读依赖经验PCR及qPCR法扩增16SrRNA保守序列，4至6小时灵敏度高，适合大规模筛查《中国药典》2025版规定：主细胞库、工作细胞库等进行支原体检查时，应同时采用培养法和指示细胞培养法，也可采用经认可的qPCR法。qPCR方法与检测策略将金标准方法与快速方法科学组合、分层应用，可构建覆盖全生命周期的污染防控体系qPCR方法优势针对支原体

16SrRNA

等保守序列设计引物探针，采用荧光探针法定量检测全程仅需

几小时，灵敏度可达

10CFU每毫升可覆盖多个种属支原体则方法选择原则药典优先培养法与指示细胞培养法为药典金标准，用于合规放行与最终结论判定方法互补qPCR快速检测适用于原材料入厂筛查、生产过程监控及紧急放行检测限达

10CFU每毫升

可替代培养法，达

100CFU每毫升

可替代指示细胞培养法，前提是完成充分验证支原体防控核心策略长期使用常规抗生素会掩盖污染，同时筛选出耐药支原体菌株，反而增加防控难度。预防是核心，现有消除方法成功率仅66%至85%且易复发检强制检疫检疫隔离新细胞系隔离检疫，连续2次检测阴性后方可进入常规培养区无严格无菌无菌操作单人单株处理细胞，试剂耗材专人专用优优选试剂辐照处理优先选择辐照处理的血清与胰酶，可疑试剂用0.1微米滤膜低压差过滤慎慎用抗生素禁用常规培养禁用抗生素，仅原代培养初期短期使用，不超过2周CHAPTER实验室管理与长效保障制度落地，才能让规范成为习惯从人员管理到生物安全动态的全面保障05细胞实验室规章制度实验室规章制度是规范操作落地的制度保障人员准入实验人员须先学习规章制度和操作要求，通过操作考核后方可进入细胞实验室。严禁未经许可擅自进入，非实验人员未经允许不得进入。着装与物品传递须在缓冲间更换专用实验服、鞋、帽、口罩，严禁不换装进入。进出实验室的器械、试剂和物品须经传递窗紫外线消毒，不可紫外线消毒的用酒精消毒后进入。日常纪律实验室内不得进行微生物等易污染物培养，禁止吸烟、饮食，保持清洁、整齐、安静。人员培训与设备管理人员管理实验人员须经严格专业培训，掌握细胞培养基本操作规范定期开展新设备使用、新技术推广、消防安全、生物安全等培训进入细胞培养间需登记进入和离开时间仪器设备管理培养箱、显微镜、离心机、洁净工作台等应定期校准和维护精密仪器需预约使用，用后恢复原位并填写使用记录培养箱温度、二氧化碳浓度等参数须定期监测并记录，确保稳定培养条件设备使用后及时清洁、消毒，避免细胞间的交叉污染试剂耗材与卫生管理