蛋白免疫印迹技术全面实验操作课件

WESTERNBLOT蛋白免疫印迹技术全面实验操作从原理到条带：研究生必备的WB实验全流程指南汇报人：实验教学组课程导览01原理基石抗原抗体结合与电泳分离的认知框架02操作流程八大核心步骤的时序拆解03问题攻坚异常条带的诊断与优化策略04规范护航安全规范与效率技巧沉淀原理基石先懂原理，再动手抗原抗体特异性结合，是WB一切操作的逻辑起点01WB的核心原理蛋白免疫印迹（WesternBlot）是检测特定蛋白质的经典技术，其灵魂在于两大机制的协同：电泳分离

与

抗体识别。核心机制分三步走：电泳分离→电转移→抗体识别，环环相扣完成蛋白检测闭环。三步流程详解原理总览一句话概括：“探针”是一抗，“显色”靠标记二抗，最终通过ECL反应实现目标蛋白的定性与半定量检测。第一步SDS电泳分离按

分子量大小

将复杂蛋白混合物分离开第二步电转移固定到膜将凝胶上的蛋白

固定到固相膜（PVDF或NC膜）第三步抗体识别抗体识别与显色特异性一抗识别目标蛋白，酶标二抗放大信号，化学发光显影抗原抗体结合机制WB的检测特异性，根植于

抗原-抗体特异性结合

这一免疫学基本原理。1一抗识别一抗

特异识别目标蛋白的特定表位，形成抗原抗体复合物2洗脱洗去未结合的一抗后，只有目标蛋白位置保留抗体信号3二抗结合二抗

针对一抗的种属来源（如抗鼠IgG），携带HRP酶标记4酶催化信号酶催化底物产生可检测信号，指示目标蛋白位置技术定位与灵敏度融合了凝胶电泳的高分辨率与固相免疫测定的特异敏感两大优势。WB被誉为蛋白表达检测的"金标准"灵敏度高灵敏度低至

1~5ng常规检测阈值最低

10~100pg中等大小靶蛋白足以应对绝大多数常规科研场景下的蛋白表达分析需求双维鉴定双维度表达水平

鉴定蛋白表达量的定量评估分子量大小

鉴定蛋白大小的精确判定定性与半定量核心工具定性判断有无表达的确认判定半定量比较蛋白研究中不可替代的核心工具三大应用场景WB的价值不仅在于检测，更在于它能支撑多条研究路径。三大研究路径如何借助

WB

落地从信号通路研究到疾病标志物筛选，WB始终是贯穿蛋白研究的通用语言。表达分析定性/半定量目标蛋白特异性表达的定性或半定量分析相互作用研究互作验证蛋白-蛋白、蛋白-DNA

相互作用后续分析的验证手段修饰鉴定翻译后修饰蛋白翻译后修饰（磷酸化、糖基化、乙酰化等）的检测操作流程细节决定条带八大步骤环环相扣，每一步都是成败关键02实验前仪器与试剂准备充分的准备是实验流畅的前提。WB涉及设备与试剂众多，建议开工前逐项核对。核心仪器低温高速离心机、超声破碎仪、组织匀浆器酶标仪、恒温水浴锅/金属浴制胶架/玻璃板、湿转电泳槽/转印槽化学发光成像仪、摇床、制冰机关键试剂RIPA裂解液、蛋白酶/磷酸酶抑制剂、BCA定量试剂盒丙烯酰胺、APS、TEMED、电泳/转膜缓冲液脱脂奶粉、BSA、TBST、一抗、二抗、ECL发光试剂蛋白提取：低温与抑制样本质量决定实验上限，蛋白提取必须坚守两条铁律：全程低温、抑制剂现加。“低温与抑酶双重把关，样本活性才有保障。”贴壁细胞3步预冷清洗与收集4℃预冷PBS洗2~3遍，刮下或胰酶消化收集裂解前现加抑制剂裂解液使用前才加入蛋白酶抑制剂（PMSF终浓度

1mM）与磷酸酶抑制剂定量冰上裂解按1×10⁶细胞加100μL裂解液，冰上裂解

30分钟组织样本3步冰上匀浆按0.01g加50~100μL裂解液冰上匀浆超声辅助破碎可辅以超声破碎：功率

20~30%，间隔10秒，重复3~5次离心取上清4℃12,000~20,000g离心10~20分钟，取上清即得蛋白提取液蛋白定量方法对比定量方法检测波长优势局限BCA法562nm去垢剂耐受好（≤5%SDS）、线性宽与还原剂（DTT、β-ME）不兼容Bradford法595nm快速、不受还原剂影响高浓度去垢剂（>0.1%SDS）干扰严重Lowry法540nm附近灵敏度高干扰物影响更大质标准曲线R²标准曲线

R²≥0.99，标准品（BSA）应与样品裂解液组分一致。预干扰处理DTT裂解液含DTT干扰BCA时，可用

TCA或丙酮沉淀

去除干扰物后再定量。变性处理与上样量定量之后，变性是让蛋白"就绪"的关键一环。SDS前处理：变性使蛋白充分展开并统一带负电荷，上样量依据样品类型严格校准，保证条带清晰可比。95~100℃·5~10min20~50μg/孔变性处理3步样品

×

上样缓冲液缓冲液含

SDS、甘油、溴酚蓝、还原剂（DTT或β-ME）95~100℃

加热5~10分钟使蛋白充分变性并统一带上负电荷还原剂打开二硫键DTT终浓度

50~100mM；易氧化失效，应分装

-20℃

保存上样量参考3档全细胞裂解液每孔总蛋白

20~50μg；低丰度蛋白可提高至

80~100μg内参蛋白每孔

5~10μg；纯化蛋白不超过

100ng上样体积限制不能超过胶孔容积；1.0mm胶孔最大

30~40μL制胶：浓度与细节分离胶浓度是决定分离效果的第一变量，需根据目标蛋白分子量精准选型。分离胶浓度是决定分离效果的第一变量，分子量越大，浓度越低大分子蛋白>250kDa选

6%~8%

低浓度分离胶常规/小分子常规蛋白：10%~12%小分子蛋白：提高胶浓度浓缩胶通常控制在

4%~5%操作要点灌胶后用水或异丙醇压平液面，避免直接冲击胶面插梳子时缓慢垂直，防止气泡进入梳孔聚合时间由

APS

与

TEMED

决定，通常约

30分钟；APS建议新鲜配制未聚合的丙烯酰胺有神经毒性，全程戴手套口罩防护SDS电泳操作电泳的核心在于

两段式恒压策略

，让条带先压缩后分离。浓缩胶阶段80V约

30分钟，待条带压成一线分离胶阶段100~120V调至恒压，至

溴酚蓝

到达凝胶底部附近终止操作要点先在内槽加满电泳液再垂直拔梳子，用针头拨正变形胶孔上样前用枪头轻吹胶孔，清除未聚合碎片；换样品时进样器在外槽缓冲液洗涤3次电泳产热会影响条带，可在冰浴或冷房中进行尽快上样、尽快电泳，是减少条带扩散的第一要义。转膜：膜的选择与活化膜材选择直接关系转膜效率，核心是按蛋白分子量匹配膜孔径PVDF膜特性与活化要求3项常规靶蛋白孔径

0.45μm小分子蛋白（<10kD）孔径

0.22μm，防止蛋白穿过膜孔甲醇活化需活化

10秒~2分钟，激活正电基团NC膜特性与注意事项3项常规靶蛋白孔径

0.45μm小蛋白（<20kD）不宜使用活化要求无需活化，但膜质较脆平衡浸泡要点转膜：三明治与条件第1层海绵垫负极侧胶朝负极、膜朝正极，确保电流由胶穿膜第2层滤纸负极侧黑对黑，对齐电极方向第3层凝胶负极侧每叠一层用玻璃棒或滚筒擀走气泡，膜角剪角做方向标记第4层膜正极侧白对红，膜朝正极第5层滤纸正极侧湿转通常恒流200~400mA，时间30分钟~90分钟以上第6层海绵垫正极侧大分子蛋白（>150kDa）需延长转膜时间至2小时；转膜槽置于冰浴，避免温度过高导致蛋白变性封闭：堵住背景噪音封闭的目的是覆盖膜上非特异性结合位点，选对封闭液能显著降低背景。普通蛋白优先用奶粉，遇到背景问题时果断切换

BSA封闭液选择：低背景与靶蛋白兼容性需同时兼顾5%脱脂奶粉适用于大多数蛋白普遍兼容的通用选择成本低但背景略高经济实惠，适用面广酪氨酸磷酸化禁忌BSA（3%）背景干净显著降低非特异性结合适合磷酸化蛋白或高背景要求的检测低背景需求的优选方案室温1~2小时4℃过夜pH注意一抗孵育策略一抗是保证特异性的核心，稀释比例与孵育条件须按说明书执行按抗体说明书推荐比例稀释，常见

1:1000室温孵育1~2小时或

4℃过夜；磷酸化抗体常要求

5%BSA

稀释液4℃平缓震荡过夜优先选文献报道的WB适用抗体，单克隆抗体可降低交叉反应孵育结束回收一抗，加叠氮钠抑菌后

-20℃

保存；根据分子量剪膜分别孵育，蛋白大小接近时用洗脱法（0.1MGlycinepH2.5）依次检测二抗孵育与洗膜二抗的关键是种属匹配与时间控制，洗膜则是去除背景的最后防线二抗孵育关键在种属匹配与时间控制种属匹配二抗需与一抗宿主种属匹配，如抗鼠IgG、抗兔IgG。时间控制室温孵育

30分钟~2小时，不宜过长，2小时后背景过深。HRP注意事项HRP标记二抗避免叠氮化物污染，以免抑制酶活性。洗膜规范去除背景的最后防线次数一抗、二抗孵育后均用

TBST

洗膜

3次

×5~10分钟。震荡洗膜置于摇床震荡，充分去除未结合抗体。时长背景高时增加洗涤次数至

5次，延长每次洗涤时间。显影与数据分析显影是流程的收官之战，分析则让数据产生意义。01收官环节显影操作ECL发光液A液B液按

1:1混合，现配现用。膜吸干表面水分后浸入显影液，置于化学发光成像仪曝光。保存明场照片与多个曝光时间的暗场照片，框选目的条带位置。数据分析3项软件计算灰度值目标蛋白与内参蛋白（β-actin、GAPDH）标准化处理消除上样量差异标准化是半定量比较的前提HRP直标内参抗体省略二抗步骤，快速判断上样一致性问题攻坚从踩坑到避坑看懂异常条带，才能跑出教科书级结果03无条带的排查思路表达量低表达量目标蛋白表达量过低或已降解用已知阳性样本验证一抗有效性抗体失效抗体抗体失效、不特异或浓度过低用已知阳性样本验证一抗有效性转膜不完全转膜膜与胶之间有气泡丽春红染色检查转膜效率显色不足显色显色剂过期失效、显影时间不足更换新鲜ECL显色试剂种属不匹配种属二抗与一抗种属不匹配裂解液含蛋白酶抑制剂、上样量≥20μg高背景的来源与对策主要来源5项封闭不充分延长封闭时间至1小时以上，确保膜完全浸没一抗浓度过高降低一抗浓度（如1:1000），梯度稀释测试最佳浓度洗膜不足TBST洗膜3次

×10分钟，必要时增至5次二抗孵育过长控制在2小时以内显色剂过敏感或膜干燥全流程保持膜湿润，避免直接向膜滴加液体策对应对策延长封闭至1小时以上，确保膜完全浸没梯度稀释1:1000

测试最佳浓度增加洗膜3次

×10分钟，必要时增至5次控制孵育2小时以内保持湿润避免直接向膜滴加液体非特异性条带解析源可能来源翻译后修饰磷酸化、糖基化、泛素化等翻译后修饰呈现多条带多个异构体蛋白存在多个异构体或剪切体交叉反应一抗特异性差，与相似蛋白交叉反应蛋白降解样本降解导致分子量降低解决策略3项梯度稀释一抗1:500、1:1000、1:2000

测试最佳浓度更换单克隆抗体降低交叉反应BLAST比对序列选择特异性表位抗体条带形态异常的诊断异常形态常见原因对策微笑条带凝胶浓度不均、缓冲液离子强度不均使用均匀凝胶、保证离子强度一致拖尾条带蛋白降解、电压过高、一抗浓度过高优化样本处理、降电压、降一抗浓度位置偏移电泳条件异常、蛋白修饰/异构体检查胶浓度与电压、选特异性表位抗体边缘白圈转膜气泡残留、高温蛋白变性擀走气泡、冰浴转膜条带变形胶不纯、设备老化新鲜配胶过滤、检查电泳槽稳定性五类常见异常形态，逐一对应原因与对策，快速定位问题根源小分子与大分子蛋白策略针对极端分子量蛋白的转膜难点，给出差异化参数策略蛋白分子量大小悬殊，是转膜环节最需要个性化调参的场景。差异化参数策略小小分子蛋白（<15kDa）孔径选用

0.2μm

孔径膜时间缩短转膜时间，防止蛋白穿过膜孔大大分子蛋白（>150kDa）孔径选用

0.45μm

膜，转膜时间延长至

2小时凝胶建议使用

6%~8%

低浓度分离胶，剥胶时小心操作缓冲液转膜缓冲液甲醇浓度可依蛋白极性调整，非极性蛋白可提升至

20%

增强结合规范护航规范即效率安全与细节并重，让每一次实验都可重复04安全红线：三类高危点“WB实验看似温和，实则暗藏化学与生物双重风险，务必守牢安全底线。”“安全规范不是束缚，而是保护每一个人长期做实验的前提。”

神经毒性未聚合的丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺具有神经毒性。配胶全程戴手套、口罩，避免直接接触。

蛋白酶抑制剂毒性PMSF

高毒性且在水中半衰期极短。操作时注意自我防护，使用前才添加。

仪器安全电泳、转膜设备涉及高电压。检查设备是否漏液、电压是否稳定，避免漏电风险。样本保存规范“蛋白样本的稳定性，直接决定结果的重复性。分装+避免反复冻融是铁律。”把“一次一分装”变成习惯，样本质量的稳定性就有了保障。−80℃分装长期保存提取好的蛋白分装后保存于

-80℃，按需