【《藜麦皂苷的提取实验探究案例》4600字】

藜麦皂苷的提取实验探究案例1.1材料与仪器1.1.1材料白藜麦：将藜麦种子除杂后经粉碎机粉碎后过60目（孔径0.3mm）筛，制得藜麦粉末。将藜麦粉末置于石油醚中浸泡过夜，反复两至三次，至石油醚溶液无色为止，抽滤后晾干，滤饼即为脱脂处理的藜麦粉末样品，备用；石油醚可旋转蒸发后回收重复利用。1.1.2试剂藜麦皂苷提取实验中所需的试剂如表6所示。表6藜麦皂苷提取所需试剂Tab.6Reagentsforextractionofquinoasaponins试剂名称规格购买单位齐墩果酸标准品中国食品药品检定研究院无水甲醇分析纯天津市天大化工实验厂香草醛分析纯天津市大茂化学试剂厂冰乙酸分析纯天津市天大化工实验厂硫酸分析纯成都市科隆化学品有限公司石油醚分析纯天津市大茂化学试剂厂乙醇分析纯天津市天大化工实验厂1.1.3主要仪器与设备藜麦皂苷提取实验中所需的主要仪器与设备如表7所示。表7藜麦皂苷提取所需仪器设备Tab.7Theapparatusandequipmentfortheextractionofquinoasaponins仪器设备生产厂家CP214电子天平奥豪斯仪器（常州）有限公司电热恒温鼓风干燥箱上海跃进医疗器械有限公司YXSF_500中药粉碎机上海百航实业有限公司国家统一标准筛（60目）浙江省上虞市钱上金属编织厂HH-4数显恒温水浴锅常州普天仪器制造有限公司UV1100分光光度计长沙科美分析仪器有限公司DL-0506低温冷却液循环泵河南兄弟仪器设备有限公司YRE2000E旋转蒸发仪巩义市予华仪器有限责任公司SHZ-D(Ⅲ)型循环水真空泵郑州予华仪器制造有限公司KM-300DE中文液晶台式超声波清洗器昆山美美超声仪器有限公司扫描电子显微镜VEGAⅡRSU型TESCAN公司spectrumtwo型红外光谱仪PerkinElmer公司1.2实验方法1.1.1标准曲线的绘制齐墩果酸标准曲线绘制方法如图1所示。图1齐墩果酸标准曲线绘制过程示意图Fig.1Schematicdiagramofoleanolicacidstandardcurvedrawingprocess1.1.2样品溶液的制备取去脂藜麦粉末1.000g放置圆底烧瓶中，加入20.0mL浓度为70％的乙醇溶剂，以一定的超声时间、超声功率和附加压力提取，过滤后将滤液置于70℃水浴锅上水浴蒸干，用甲醇溶解并定容至25.0mL，即得样品溶液。1.1.3皂苷含量的测定准确量取0.25mL样品溶液，置于20.0mL的具塞试管中，在70℃的水浴锅上挥干溶剂，利用1.1.1的方法，在最大的吸收波长处测定吸光度，根据标准曲线回归方程计算得到皂苷浓度。1.1.4皂苷得率计算式中，C表示根据标准曲线求得的皂苷质量浓度(mg/mL)；V表示提取液总体积(mL)；m表示样品质量(g)。1.1.5单因素实验精密称取15份1.000g处理后备用的藜麦粉，1）采用超声辅助提取法，以70％乙醇在料液比1:20，超声功率270W的条件下，固定超声温度40℃，超声时间为变量，分别为5min、10min、15min、20min、25min，提取藜麦中的皂苷，每组三个平行；2）采用超声辅助提取法，以70％乙醇在料液比1:20，超声功率270W的条件下，固定单因素实验选出的最优超声时间，超声温度为变量，分别为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，提取藜麦中的皂苷，每组三个平行；3）采用超声-负压辅助提取法，以70％乙醇在料液比1:20，超声功率270W的条件下，固定单因素实验选出的最优超声时间和超声温度，负压为变量，分别为0.03MPa、0.04MPa、0.05MPa、0.06MPa、0.07MPa，提取藜麦中的皂苷，每组三个平行；并分别制成样品溶液，测定皂苷的含量，计算皂苷得率。1.1.6响应面实验在单因素实验结果的基础之上，设计Box-Behnken中心组合实验，进行三因素三水平的试验设计，选取上述三个影响因素为自变量，进行响应面分析试验。1.1.7藜麦总皂苷SEM表征利用扫描电子显微镜分析和描述藜麦籽粒细胞壁结构在不同提取条件下提取皂苷后的变化。SEM表征检测条件为：加速电压（HV）20.0kv，放大（MAG）200kx、工作距离（WD）7.08mm。1.1.8藜麦总皂苷FTIR表征使用红外光谱仪对提取得到的藜麦总皂苷进行中红外波谱分析，FTIR表征条件：KBr压片，分辨率

0.01cm-1，测量频率范围4000~450cm-1。1.1.9数据处理实验数据采用origin2017进行相关处理，实验进行了3次重复。1.3结果与分析1.3.1最大吸收波长的确定将齐墩果酸标准溶液按照1.1.1的方法显色后，用紫外分光光度计在300~900nm处进行扫描，齐墩果酸标准溶液显色后吸收曲线图如图2所示。由图2可知，齐墩果酸标准品在551nm附近有最大吸收，因此，确定其测定波长为551nm。图2齐墩果酸标准溶液显色后吸收曲线Fig.2Absorptioncurveofoleanolicacidstandardsolutionaftercoloration1.3.2齐墩果酸标准曲线图3齐墩果酸标准曲线Fig.3Standardcurveofoleanolicacid以齐墩果酸的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，齐墩果酸标准曲线如图3所示，标准曲线回归方程为y=66.73856x-0.03419，R2=0.99865，在此范围内（0-0.018mg·mL-1）有良好的线性关系。1.3.3单因素实验结果（1）超声时间对藜麦总皂苷得率的影响图4超声辅助提取法中超声时间对藜麦总皂苷得率的影响Fig.4Effectofultrasonictimeontheyieldofsaponinsinultrasound-assistedextraction超声时间对藜麦总皂苷提取得率的影响结果如图4所示。由图4可知，超声时间为5min到20min之间时，皂苷得率随超声时间的增加整体呈增加的趋势；当超声时间由20min到25min时，藜麦皂苷得率随时间的增加呈减少趋势。这可能是因为当超声时间较短时，藜麦中皂苷的提取率随着时间的增加而增多，而当时间过长时，提取量随时间的变化不显著，且超声波有可能会对皂苷的结构造成了破环，导致皂苷得率下降。因此，超声时间为20min时是最优提取条件，此时藜麦皂苷提取率达到10.587±0.285mg·g-1。（2）超声温度对藜麦总皂苷得率的影响图5超声辅助提取法中超声温度对藜麦总皂苷得率的影响Fig.5Effectofultrasonictemperatureontheyieldofsaponinsinultrasound-assistedextraction超声温度对藜麦总皂苷得率的影响结果如图5所示。由图5可知，在超声温度在20℃到60℃的范围内，藜麦皂苷得率与超声温度呈正相关。因为皂苷在高温下更易溶解，但温度过高可能会使皂苷失活，所以把超声温度为60℃作为最优提取条件，此时藜麦皂苷提取率达到11.664±0.235mg·g-1。（3）负压对藜麦总皂苷得率的影响图6超声-负压辅助提取法中外加负压对藜麦总皂苷得率的影响Fig.6Effectofnegativepressureontheyieldofsaponinsinultrasonic-negativepressureassistedextraction负压对藜麦皂苷得率的影响如图6所示，由图6可知，在负压0.03MPa到0.04MPa以及0.06MPa到0.07MPa间皂苷得率与负压呈正相关，在0.04MPa到0.06MPa间皂苷得率随负压增加呈下降趋势，且整体误差偏大，有可能是因为外加的负压不好控制操作所导致的。因为在负压为0.04Mpa时藜麦的皂苷得率最高，所以选择0.04MPa作为最优提取条件，此时藜麦皂苷提取率达到11.793±0.279mg·g-1。1.3.4响应面实验设计及结果分析根据超声-负压辅助提取法的单因素实验结果，选取超声时间、超声温度以及负压三个因素，以藜麦皂苷得率为影响值，利用DesignExpert12软件进行Box-Behnken试验设计，因素水平表见表8。表8Box-Behnken试验因素水平表Tab.8Box-Behnkentestfactorleveltable因素水平-101A时间（min）152025B温度（℃）506070C负压（MPa）0.030.040.05将各因素按表8所示的因素水平，通过响应面分析法进行三因素三水平的实验设计优化超声-负压辅助提取法的提取工艺条件，结果如表9所示。表9Box-Behnken试验设计及结果Tab.9Box-Behnkenexperimentaldesignandresults实验号ABCY皂苷得率(mg/g)1-1-1011.0724211010.9005300011.9229410111.8324501-110.98206-10-111.5972710-111.678681-1011.1991900011.38431000011.21241100011.97721201111.5158130-1111.66051400011.1220150-1-110.918616-11010.638217-10111.7691通过DesignExpert12软件对数据进行回归拟合分析，得到藜麦皂苷得率与超声时间(A)、超声温度(B)、负压(C)之间的多元二次回归模型方程为：Y=11.12+0.0667*A-0.1018*B+0.2002*C+0.0339*AB-0.0045*AC-0.0520*BC-0.3606*A2-0.8107*B2-0.0439*C2表10回归方程方差分析表Tab.10Regressionequationanalysisofvariancetable来源平方和自由度均方F值P值显著性模型3.9690.43989.90.0032显著A0.035610.03560.80170.4003B0.082810.08281.87000.2143C0.320610.32067.220.0312AB0.004610.00460.10350.7571AC0.000110.00010.00180.9669BC0.010810.01080.24380.6366A20.547410.547411.320.0099B21.7711.7761.3<0.0001C20.008110.00810.18250.682表10（续表）来源平方和自由度均方F值P值显著性残差0.310970.0444失拟项0.173330.05781.680.3074不显著净误差0.137640.0344总离差4.2716试验结果方差分析如表10所示，由表10可知，模型的Р值=0.0032<0.01，回归模型具有高度的显著性，失拟值P=0.3074>0.05，失拟不显著，说明二次响应曲面回归方程能够很好的拟合本试验所得的结果。回归模型决定系数R2=0.9272，表明得率的实际值和预测值之间有较好的拟合度，可以很好的描述回归方程各因素与响应值之间的真实关系。模型调整决定系数R2Adj=0.8335，表明模型可以解释83.35%的响应值变化。分析表中还可知，二次项A2、B2的P值小于0.01，对皂苷得率的影响高度显著，一次项C的P值小于0.05，对皂苷得率的影响显著，其余项对皂苷得率影响不显著。从F值的大小可以看出，三个因素对藜麦皂苷得率的影响由大到小为：负压>超声温度>超声时间。基于二次回归模型进行响应面绘图，分别给出了各因素间交互影响的响应面图和等高线图，如图7到图9所示。由图可以清楚的观察各因素对总皂苷得率的影响以及各因子间两两交互作用。(a)(b)图7超声-负压辅助提取法中时间与温度交互作用对皂苷得率的响应面(a)及等高线图(b)Fig.7Responsesurface(a)andcontourplot(b)ofsaponinsyieldundertheinteractionoftimeandtemperatureinultrasonic-negativepressureassistedextraction(a)(b)图8超声-负压辅助提取法中时间与负压交互作用对皂苷得率的响应面及等高线图Fig.8Responsesurface(a)andcontourplot(b)ofsaponinsyieldundertheinteractionoftimeandnegativepressureinultrasonic-negativepressureassistedextraction(a)(b)图9超声-负压辅助提取法中温度与负压交互作用对皂苷得率的响应面及等高线图Fig.9Responsesurface(a)andcontourplot(b)ofsaponinsyieldundertheinteractionoftemperatureandnegativepressureinultrasonic-negativepressureassistedextraction由图7(a)可知，皂苷得率随着超声时间和超声温度两因素的增大而增大，到达极值后随着超声时间的增大而减小；由图7(b)可知，超声时间与超声温度的变化等高线呈椭圆形，说明超声时间和超声温度两因素对皂苷得率影响的交互作用明显，且超声温度相较于超声时间对皂苷得率影响稍强一些，与方差分析结果相符。由图8(a)可知，皂苷得率随着超声时间的增大而增大，到达极值后随着超声时间的增大而减小，在实验范围内（0.03-0.05MPa）皂苷得率随着负压的增大而增大；由图8(b)可知，负压的变化曲面比超声时间的变化曲面陡峭，说明负压相较于超声时间对皂苷得率影响更显著一些，与方差分析结果相符。由图9(a)可知，皂苷得率随着超声温度的增大而增大，到达极值后随着超声温度的增大而减小，在实验范围内（0.03-0.05MPa）皂苷得率随着负压的增大而增大；由图9(b)可知，负压的变化曲面比超声温度的变化曲面陡峭，说明负压相较于超声温度对皂苷得率影响更显著一些，与方差分析结果相符。综合以上实验结果，依据响应面分析得到超声-负压辅助提取法提取藜麦皂苷的最佳工艺条件为：超声时间20.359min、超声温度58.628℃、负压0.064Mpa，此工艺参数下预测藜麦皂苷得率为11.369mg/g。结合实验的可操作性及准确性，将工艺参数调整为：超声时间20min、超声温度59℃、负压0.065Mpa，在此条件下重复三次实验，得出平均皂苷提取量为11.952±0.341mg/g，与预测的最优结果相近，说明经响应面优化得到的提取条件可靠。1.3.5不同方法提取藜麦皂苷样品粉末SEM表征超声时间、超声温度及负压对藜麦细胞壁破损程度的影响结果如图10所示。图10中各提取条件分别为1.1.5单因素实验中每组的最优条件及响应面设计计算得出的最优工艺条件，提取率和皂苷含量越高，细胞破损程度越高，由图10-1和图10-2可知，细胞的破损程度依次：超声时间20min、超声温度59℃、负压0.065Mpa>超声时间20min、超声温度60℃、负压0.04Mpa>超声时间20min、超声温度60℃>超声时间20min、超声温度40℃；其对应的藜麦皂苷得率分别为11.952±0.341mg/g>11.793±0.279mg·g-1>11.664±0.235mg·g-1>10.587±0.285mg·g-1(Ⅰ)t超声=20minT超声=40℃(Ⅱ)t超声=20minT超声=60℃图10-1藜麦粉不同提取条件作用后的SEM图Fig.10-1SEMimageofquinoapowderafterdiffe