CN119488611A 一种工程化树突状细胞制剂及其制备方法和应用 （中国科学院上海药物研究所）

一种工程化树突状细胞制剂及其制备方法本发明公开了一种工程化树突状细胞制剂细胞不仅可以通过Fas/FasL介导的细胞凋亡作通过释放RvE_1减少炎症性细胞向炎症部位的迁2优选地，叠氮基糖类似物通过与过表达FasL所述过表达FasL的树突状细胞通过基因工程优选地，所述基因工程的方法为使树突状细胞中包含F选地，FasL基因过表达质粒结构为通过将FasL基因引入pHBLV_CMV_MCS_3FLAG_EF1_ZsGreen_T2A_PURO质粒载体中而得到的pHBLV_FASLG_CMV_MCS_3FLAG_EF1_ZsGreen_T2A_脂酰磷脂酰乙醇胺_聚乙二醇(DSPE_PEG)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺_聚乙二醇_二苯并环辛优选地，包载抗炎药物的脂质体中包载的抗炎药物选酸、6_巯基嘌呤，优选地，所述抗炎药物选自ResolvinE1、ResolvinD1、ResolvinD2、所述工程化树突状细胞制剂中，脂质体与树突状细胞的比例为503.一种过表达FasL的树突状细胞的制备方法，其由(1)构建FasL基因过表达质粒，并使用慢病毒载体、腺病毒载体或阳离子脂质载体包(2)用粒细胞_巨噬细胞集落刺激因子和IL_4诱导来自血液或骨髓的单核细胞产生树构建FasL基因过表达质粒通过基因工程的方法获得；优3用于诱导单核细胞产生树突状细胞的粒细胞_巨噬细胞集落刺激因子和IL_4浓度分别使用含10％血清的完全培养基将单核细胞分散为1x106_1x107个/mL，贴壁培养8_24将经包装的FasL基因过表达质粒转染至步骤(2)诱导产生的树突状细胞的具体步骤包在对单核细胞诱导培养的第5天，对悬浮细胞进行计数，向培养5.权利要求3或4所述的过表达FasL的树突状细胞的制备方法制备得到的过表达FasL(i)取脂质体材料氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)，胆固醇(Chol)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺_聚乙二醇(DSPE_PEG)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺_聚乙二醇_二苯并环辛炔(DSPE_PEG_所述抗炎药物选自消退素、对乙酰氨基酚、水杨酸、6_巯基嘌呤等，优选为47.权利要求6所述的包载抗炎药物的脂质体的制备方法制备得到的包载抗炎药物的脂5[0002]肠道的炎症微环境与多种疾病的发生发展密切相关，包括炎症性肠病(IBD)和肠[0003]Fas受体是死亡受体家族最主要的成员之一。当与其天然配体Fa[0004]考虑到T细胞过度激活是肠道炎症微环境的重要诱导因素之一，本发明分析肠炎[0009]本发明的再一个目的是提供上述工程化树突状细胞、过表达FasL的树突状细胞6的树突状细胞通过叠氮基糖类似物与所述包载抗炎药物脂质体表面的炔基偶联(点击化[0014]在一些实施方式中，所述过表达FasL的树突状细胞可以通过基因工程的方法获表达质粒结构可以为通过将FasL基因引入pHBLV_CMV_MCS_3FLAG_EF1_ZsGreen_T2A_PURO质粒载体中而得到的pHBLV_FASLG_CMV_MCS_3FLAG_EF1_ZsGreen_T2AResolvinE1；在一些实施方式中，抗炎药物与氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)FasL基因过表达质粒的慢病毒载体、腺病毒载体或阳离子脂质载体转染树突状细胞后获7[0020](2)用粒细胞_巨噬细胞集落刺激因子(GM_CSF)和IL_4诱导来自血液或骨髓的单入pHBLV_CMV_MCS_3FLAG_EF1_ZsGreen_T2A_PURO质粒载体中而得到的pHBLV_FASLG_CMV_MCS_3FLAG_EF1_ZsGreen_T2A_8_24小时；随后吸取悬浮细胞和上清培养基，向其中加入含GM_CSF和IL_4浓度分别为10_[0029]在一些实施方式中，来自骨髓的单核细胞可以通过分离并培养骨髓原代细胞获醇胺_聚乙二醇(DSPE_PEG)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺_聚乙二醇_二苯并环辛炔(DSPE_PEG_8在30℃90℃下水化；随后在高压或高剪切力条件下处理，获得所述包载抗炎药物的脂质[0041]在一些实施方式中，步骤(ii)中，所述包载抗炎药物的脂质体的粒径为100~9在多种类型的肠道炎症和肠炎相关肿瘤的治疗[0066]图6是实施例2中工程化树突状细胞FasL表达的免疫荧光染色图片；FasL由Alexa[0068]图8是实施例3中工程化树突状细胞经腹腔注射给药24h后在小鼠肠道的分布情[0069]图9是实施例4中工程化树突状细胞在小鼠模型中诱导肠炎部位活化T细胞减少的[0070]图10是实施例4中工程化树突状细胞在小鼠模型中诱导肠炎部位中性粒细胞减少[0071]图11是实施例5中工程化树突状细胞在DSS诱导的小鼠急性肠炎模型中的药效学[0072]图12是实施例6中工程化树突状细胞在TNBS诱导的小鼠急性肠炎模型中的药效学[0073]图13是实施例7中工程化树突状细胞在小鼠炎症诱导性肠癌模型中的药效学评申请专利范围中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，皆具有本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当或其他任何类似用语均属于开放性连接词(open_endedtransitionalphrase)，其意欲涵盖非排他性的包括物。举例而言，含有复数要素的一组合物或制品并不仅限于本文所列出的这些要素而已，而是还可包括未明确列出但却是该组合物或制品通常固有的其他要素。由所有整数数值所界定的次级范围，且应视为成是本文已特定公开了由任一对该范围的上限或较佳值与该范围的下限或较佳值构成的并不受前述现有技术或发明内容或以下具体实施方式或实施例中所描述的任何理论的限[0078]氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇(Chol)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺_聚乙二醇(DSPE_PEG)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺_聚乙二醇_二苯并环辛炔(DSPE_PEG_DBCO)均购买于基因引入pHBLV_CMV_MCS_3FLAG_EF1_ZsGreen_T2A酰基N_叠氮乙酰基氨基甘露糖(Ac4ManNAz)购自阿拉丁科技(中国)有限公司；1640培养基6_三硝基苯磺酸(TNBS)、偶氮甲烷(AOM)购自大连美伦生物技术有限公司；葡聚糖硫酸钠(DSS)购自翌圣生物科技有限公司；Anti_CD11b_FITC，Anti_Ly_6G_PerCp_Cy5.5，Anti_实验操作均严格按照中国科学院上海药物研究所实验动物管理和使用伦理委员会的相关[0080]旋转蒸发仪(Heidlph，德国)；高压均质机(Microfluidizer，美国)；透射电镜乙醇胺_聚乙二醇(DSPE_PEG)2.5mg和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺_聚乙二醇_二苯并环辛炔后使用高压均质机处理获得的脂质体以获得最终的装载RvE_1的脂质体[0085]图2是使用透射电镜对获得的未载药脂质体(图2中A)和包载RvE_1的脂质体((图1由图2_3可知，未载药脂质体粒径约为145nm，PDI值为培养基将单核细胞分散为2×106个/mL并以1mL/孔加入12孔细胞培养板内贴壁12小时；随后吸弃每孔内悬浮细胞和上清培养基，向其中加入含粒细胞_巨噬细胞集落刺激因子(GM_CSF)和IL_4浓度分别为20ng/mL和10ng/mL的1640培养基培养2_3天，培养条件为37℃细胞孔内悬浮细胞进行计数，向培养基中分别加入感染复数(MOI，MultiplicityofInfection)为25的装载FasL基因过表达质粒的慢病毒或不装载质粒的慢病毒，并加入2μL5分钟，在生理盐水中重分散为100万/mL的细胞悬液，即获得过表达FasL的树突状细胞浮细胞，通过流式细胞术或免疫荧光成像技术检测细胞表面N3的表达情况或FasL表达情况。图5是使用共聚焦荧光显微镜(CLSM)观突状细胞(FasL_DC)FasL表达的免疫荧光染色图片，其中，FasL由AlexaFlour488进行标[0091]吸取另一部分与Ac4ManNAz共培养3天后的悬浮的树突状细胞(FasL_DC)和未与Ac4ManNAz共培养的悬浮的树突状细胞(Fas细胞脂质体偶联情况，结果见图7，其中以没有与Ac4ManNAz共培养的FasL_DC作为空白对究状细胞(DC_Lipo)，过表达FasL的树突状细胞(FasL_DC)和工程化树突状细胞(FasL_DC_Lipo)对小鼠进行腹腔注射给药(脂质体给药量为100μg/只，细胞给药量为2.5×106细胞/树突状细胞能显著降低肠炎小鼠结肠组织T细胞和中性粒细胞比例，其比例降至与健康组硝基苯磺酸(TNBS)水溶液缓慢滴加在背部皮肤，并轻轻抹匀，并在7天后，将150μL含有细胞(FasL_DC)和工程化树突状细胞(FasL_DC_Lipo)对小鼠进行腹腔注射给药(脂质体给[0104]将C57BL/6小鼠分为6组，每组5只。健康组使用正常饮用水饲养。模型组中，对C57BL/6小鼠进行腹腔注射10mg/mL偶氮甲烷(AOM)水溶液100μL，使用正常