地下水细菌总数检验规范

地下水细菌总数检验规范1范围本规范规定了地下水细菌总数检验的样品采集、运输保存、实验室检验、质量控制、结果报告及生物安全管理的全流程技术要求，适用于城乡集中式饮用水源地地下水、农村分散式地下水、工业周边监测点地下水及地质勘查区域地下水的细菌总数检测工作，其他类型地下水的细菌总数检验可参照执行。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T14848地下水质量标准HJ164地下水环境监测技术规范GB4789.2食品微生物学检验菌落总数测定WS/T770生活饮用水水质检验方法微生物指标GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1地下水细菌总数指1mL地下水样品在营养琼脂培养基中，于36℃±1℃恒温条件下培养48h后，所生长的细菌菌落总数，不包含严格厌氧菌、嗜热菌、特殊营养需求菌及已死亡的细菌，结果以CFU/mL（菌落形成单位/毫升）表示。3.2无菌操作指在样品采集、处理、接种、培养的全过程中，采取严格的措施防止外界微生物污染样品，同时避免样品中的微生物污染环境和操作人员的操作规范。3.3空白对照指在检验过程中，使用无菌水代替样品，按照与样品检验完全相同的步骤和条件进行操作，用于检验培养基、试剂、器皿及操作过程是否存在微生物污染的对照实验。4样品采集4.1采样前准备4.1.1采样容器准备采用带密封螺旋盖的500mL硬质硼硅酸盐玻璃瓶或耐高温聚丙烯塑料瓶作为采样容器，使用前需经121℃高压蒸汽灭菌20min，灭菌后放入无菌间干燥保存，保存期限不超过7天。若采样点距离实验室超过48h路程，可选用预灭菌的一次性无菌采样瓶，使用前检查包装完整性，若包装破损、漏气或超过保质期严禁使用。4.1.2采样工具准备专用采样器、潜水泵、贝勒管等采样工具使用前需进行去污清洗，随后用去离子水冲洗3次，采样前用待采地下水润洗3次；若采集深层承压水样品，需确保采样泵排水口的水流稳定且无气泡产生，排水时间不少于井管水柱体积的3倍，待水温、pH、电导率等现场参数稳定后再开始收集样品。4.1.3采样人员防护采样人员需穿戴经过灭菌处理的一次性乳胶手套、无菌工作服和口罩，操作过程中手套不得接触采样容器内壁及瓶口，若手套不慎接触非无菌物品，需立即更换手套。采样现场严禁吸烟、饮食，避免人员活动产生的气溶胶污染样品。4.2采样操作4.2.1自来水龙头/民用压水井采样先打开水龙头或压水井装置，放水5~10min，直至管道内的滞留水完全排出，待水流流速稳定后，用酒精灯灼烧水龙头出水口3s~5s进行消毒，或用75%酒精棉球擦拭出水口内外壁，随后将水流调至适中，打开采样瓶瓶盖，使瓶口正对水流方向，让水样自然流入瓶内，注意水流不得溅出，也不得让瓶口接触水龙头。样品采集至采样瓶标称容积的90%即可，不要完全装满，预留适当空间便于实验室检验前振摇混匀。4.2.2天然泉眼/露天地下水露头采样在泉眼涌水的主流区域采样，避免采集表层漂浮有杂物、或底部有沉积物扰动的水样。采样时手持采样瓶下部，将瓶口朝下斜插入水下10cm~15cm处，缓慢转动瓶身使水样充满容器，过程中避免搅动水底沉积物，若泉眼流量较小，可使用无菌移液管吸取中间层水样转移至采样瓶中，严禁直接将采样瓶放置在水底舀取样品。4.2.3监测井采样先使用贝勒管缓慢下放至监测井的采样深度，通常为地下水位以下1m~2m处，待贝勒管完全充满水样后匀速提出水面，避免提拉过程中搅动井水造成沉积物悬浮。将贝勒管中的水样沿采样瓶内壁缓慢倒入，减少冲击产生的气泡，每口监测井需采集3份平行样品，采样后立即标注样品编号。4.3样品信息记录采样完成后立即在采样瓶身粘贴防水标签，标注内容包括：样品编号、采样点名称、经纬度、采样深度、采样日期和时间、采样人员姓名、现场水温、pH值、溶解氧含量。同时填写采样记录单，记录采样点地质条件、周边污染源分布、地下水用途、现场是否有异味或肉眼可见物等信息，记录单随样品一同运输至实验室。5样品运输与保存5.1运输条件样品采集后需立即放入冷藏箱中运输，冷藏箱温度控制在0℃~4℃，避免样品受到阳光直射和剧烈震荡。冷藏箱内需放置温度记录仪，全程记录运输过程中的温度变化，若运输过程中温度超过4℃的时间超过2h，该批次样品需判定为不合格，需重新采样。运输过程中采样瓶需竖直放置，用缓冲泡沫固定，防止瓶盖松动、样品泄漏，严禁将样品与有毒有害化学物品、其他生物样品同箱运输。5.2保存期限地下水细菌总数检验的样品从采样到检验的间隔时间不得超过24h，若在0℃~4℃条件下保存最长可延长至48h，超过48h的样品不得用于细菌总数检验，需注明原因后按医疗废物处理。实验室接收样品时需检查样品标签完整性、包装是否泄漏、运输温度记录是否符合要求，对不符合要求的样品予以拒收，并告知采样单位重新采样。6实验室检验6.1实验前准备6.1.1培养基制备采用营养琼脂培养基作为细菌总数测定的通用培养基，配方为：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15g~20g、蒸馏水1000mL，pH值调整为7.2~7.4。配制时将各成分溶解于蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装到三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌15min，灭菌后取出放置在45℃~50℃水浴中保温备用，培养基灭菌后保存期限不超过2周，若出现沉淀、变色、污染等情况严禁使用。6.1.2器皿准备移液枪枪头、培养皿、试管、涂布棒等玻璃器皿和塑料耗材需经121℃高压蒸汽灭菌20min，灭菌后放入干燥箱中105℃烘干备用，一次性无菌培养皿、无菌枪头需检查包装完整性，使用前不得提前打开包装。超净工作台使用前需开启紫外灯照射消毒30min，同时开启风机通风10min，用75%酒精擦拭工作台面，待紫外灯关闭5min后再开始操作。6.2样品处理检验前将样品从冷藏箱中取出，在室温下放置10min~15min，待样品温度恢复至室温后，手持采样瓶上部，将样品反复振摇20次~30次，使水样中的细菌均匀分散。振摇时注意不要让水样溅到瓶口内侧，避免污染。若地下水样品中含有较多泥沙等悬浮物，可静置1min，取上层匀质水样进行检验，不得过滤或离心处理样品，避免去除样品中的细菌。6.3稀释与接种6.3.1稀释液制备采用灭菌生理盐水作为稀释液，称取8.5g氯化钠溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压蒸汽灭菌15min后备用。根据地下水的预期污染程度确定稀释梯度，对于未受污染的饮用水源地地下水，通常采用原液、1:10两个稀释梯度；对于周边有工业污染源、生活污水排放口的地下水，需增加1:100、1:1000甚至更高的稀释梯度，确保最终培养的菌落数在30CFU~300CFU之间。6.3.2稀释操作取9mL灭菌生理盐水加入到无菌试管中，标注稀释度。用1mL无菌移液枪吸取1mL充分混匀的水样，沿试管壁缓慢加入到装有9mL生理盐水的试管中，注意移液枪头不要接触液面，吹打混匀3次制成1:10稀释液。更换新的无菌枪头，吸取1mL1:10稀释液加入到下一个装有9mL生理盐水的试管中，制成1:100稀释液，以此类推制备所需的稀释梯度，每递增一个稀释度必须更换一次枪头。6.3.3接种操作选择2~3个适宜的稀释度，每个稀释度接种2个平行培养皿。用无菌移液枪吸取1mL稀释后的样品，加入到无菌培养皿中，随后立即倾注约15mL温度为45℃~50℃的营养琼脂培养基，轻轻转动培养皿使样品与培养基充分混匀，同时向2个空白培养皿中加入1mL灭菌生理盐水，按相同步骤倾注培养基作为空白对照。待培养基完全凝固后，将培养皿倒置放入恒温培养箱中。6.4培养培养箱温度设置为36℃±1℃，相对湿度保持在70%左右，培养时间为48h±2h。培养过程中避免频繁开关培养箱门，每次开关门时间不超过10s，防止温度波动影响细菌生长。若需要观察菌落生长情况，可在培养24h时进行初步观察记录，但不得将培养皿长时间拿出培养箱，观察后立即放回倒置培养。6.5菌落计数培养时间结束后，立即取出培养皿，用菌落计数器或目视计数每个培养皿中的菌落数。计数时先计数空白对照培养皿，若空白对照的菌落数超过1个，说明培养基、耗材或操作过程存在污染，该批次检验结果无效，需重新检验。对于样品培养皿，选择菌落数在30CFU~300CFU之间、无蔓延菌落生长的培养皿进行计数，若所有稀释度的菌落数均大于300CFU，选择最高稀释度的培养皿计数后乘以稀释倍数；若所有稀释度的菌落数均小于30CFU，选择最低稀释度的培养皿计数后乘以稀释倍数。若培养皿中出现片状蔓延菌落，且占培养皿面积的1/4以上，该培养皿结果作废；若蔓延菌落面积小于1/4，且其余区域的菌落分布均匀，可计数1/2或1/4区域的菌落数，乘以相应倍数得到整个培养皿的菌落数。对于直径小于1mm的微小菌落、颜色与培养基接近的透明菌落，需借助放大镜进行计数，避免漏计。7质量控制7.1内部质量控制每批次检验至少设置1份空白对照、1份平行样检验，平行样的相对偏差不得超过30%，若超过30%需重新检验。每20份样品至少加做1份标准菌株质控样，采用大肠埃希氏菌（ATCC25922）或金黄色葡萄球菌（ATCC25923）作为标准菌株，制备浓度为100CFU/mL~500CFU/mL的质控样品，与待测样品同时检验，质控样品的回收率需控制在70%~130%之间，若超出范围需排查培养基、培养条件、操作过程中的问题。每季度至少进行一次人员比对实验，安排2名检验人员对同一份地下水样品进行平行检验，结果相对偏差不得超过30%，定期参加上级部门组织的微生物检验能力验证，确保检验结果的准确性。7.2外部质量控制每年至少参加2次由国家级或省级环境监测机构、卫生健康机构组织的地下水细菌总数检验能力验证或实验室间比对，比对结果需为满意。若出现不满意结果，需立即开展原因分析，制定整改措施，整改完成后重新参加比对实验，直至结果合格。8结果报告8.1结果计算若只有一个稀释度的培养皿菌落数在30CFU~300CFU之间，计算两个平行培养皿的平均菌落数，乘以稀释倍数即为样品的细菌总数。若有两个连续稀释度的培养皿菌落数均在30CFU~300CFU之间，按下式计算：[N=\frac{\sumC}{(n_1+0.1n_2)d}]式中：(N)为样品细菌总数，单位为CFU/mL；(\sumC)为两个适宜稀释度的菌落数之和；(n_1)为低稀释度的平行培养皿个数；(n_2)为高稀释度的平行培养皿个数；(d)为低稀释度的稀释倍数。计算结果保留两位有效数字，若菌落数小于100CFU/mL，保留整数位；若菌落数大于等于100CFU/mL，采用科学计数法表示。8.2报告内容检验报告需包含以下信息：样品编号、采样点名称、采样日期、检验日期、检验方法、培养条件、细菌总数结果（CFU/mL）、检验人员姓名、审核人员姓名、检验单位盖章。若样品浓度低于检出限（1CFU/mL），报告为“未检出”，并注明检出限；若样品浓度过高无法计数，报告为“多不可计”，并注明最高稀释倍数。报告结果需与GB/T14848中的地下水质量分类指标进行对比，标注对应的水质类别，对于超过Ⅲ类地下水标准的样品，需在报告备注中注明“该样品细菌总数不符合地下水Ⅲ类水质要求”。9生物安全管理检验过程中产生的废弃培养基、剩余水样、枪头、培养皿等废弃物需放入专用的高压灭菌袋中，经121℃高