CN119491017A 一种单碱基靶向编辑青花菜线粒体基因的方法及应用 （浙江大学海南研究院）

一种单碱基靶向编辑青花菜线粒体基因的本发明公开了一种单碱基靶向编辑青花菜单碱基编辑技术mitoTALECD进行青花菜线粒体基对转变为TA，编辑ORF138第42个密码子UGG对现有线粒体基因编辑技术mitoTALENs可能造成2（1b）通过网站TALENtargeter获得青花菜细胞质雄性不育相关基因ORF138的左右（2a）按照PlatinumGateTALENAssemblyKit组装试剂盒，使用试剂盒中的载体对和UGI的ORF分别转移到含有CaMV35S启动子和拟南芥ATPaseδ亚基线粒体靶向信号的Ti质（2c）通过三代测序对最终串联表达的Ti质粒进行检查；得到构建好的mitoTALECD质基因ORF138进行基因编辑，具体为：利用胞嘧啶碱基编辑器将CG碱基对转变为TA，编辑3TCD_left:TGTCCACTTTTTGTCTCD_right:TACACTAACTT的胞嘧啶脱氨酶DddA的分裂半体，即CDhalf和一个抑制生成的尿嘧啶降解的尿嘧啶糖基6.根据权利要求1所述的方法在通过线粒体单碱基编辑靶向编辑青花菜线粒体基因中4[0003]线粒体是能量产生的场所（SpinelliJB,HaigisMC.Themultifacetedcontributionsofmitochondriatocellularmetabolism[J].NatureCellBiology,2018,20(7):745_754.线粒体基因在植物育种中具有重要作用，尤其是在细胞质雄性提高了制种的效率。细胞质雄性不育通常由线粒体DNA（mtDNA）突变引起（LevingsCS,PringDR,1976.RestrictionEndonucleaseAnalysisofMitochondrial_DNAfromZhangHW,GaoCX.CRISPR/CasGenomeEditingandPrecisionPlantBreedingin编辑。上一代编辑工具TALENs仅由蛋白组成，它借助于一种由植物细菌分泌的天然蛋白东京大学农学部植物分子遗传实验室的Arimura博士团队首次建立基于mitoTALENs大片段敲除的植物线粒体基因编辑技术（KazamaT,OkunoM,WatariY,YanaseS,KoizukaC,TsurutaY,SugayaH,ToyodaA,ItohH,TsutsumiN,ToriyamaK,KoizukaN,AimuraS.CuringcytoplasmicmalesterilityviaTALEN_mediatedmitochondrialgenomeediting[J].NaturePlants,2019,5(7):722_730.但该技术在敲除线粒体基因的同时会造成线粒体基因组的重组及线粒体DNA大片段的缺失。目前尚无利用线粒体单5对TALE的重复序列进行第一步的组装，第二步使用mitoTALECD的入门载体1和入门载体3，half和UGI的ORF分别转移到含有CaMV35S启动子和拟南芥ATPaseδ亚基线粒体靶向信号的（c）根据靶位点上下游序列，提取再生植株DNA，将其作为模板进行PCR扩增，6TCD_left:TGTCCACTTTTTGTCTCD_right:TACACTAACTT嘧啶C转化为尿嘧啶U的胞嘧啶脱氨酶DddA的分裂半体，即CDhalf和一个抑制生成的尿嘧辑靶向编辑青花菜线粒体基因中的应用。图2为利用原生质体转化及sanger测序评估构建好的mitoTALECD质粒的有效性示PlatinumGateTALEN组装试剂盒(AddgeneKit#1000000043)，(https:///kits/yamamoto_plDddtoxA_C，E1pENTRL1_L4NGG1397_DddtoxA_C，或E1pENTRL1_L4NIG1397_DddtoxA_C)，入门载体2(pENTRE2HSPter_35Sp_mito)和入门载体3(E3pENTRL3_L2NNG1397_DddtoxA_N,E3pENTRL3_L2NIG1397_DddtoxA_N,E3pENTRL3_L2HDG1397_DddtoxA_N,或E3pENTRL3_L2NGG1397_DddtoxA_N)和目标载体(pDESTpK7WG2mito)。所有克隆及其序列可从Addgene获得（/7ORF138第42个密码子UGG对应的序列TGG上下游，识别位点前的第一个碱基为T，长度应为ORF138构建的mitoTALECD载体TCD1的靶位达到入门载体1和3与图1中的（b）中的反应兼容。图1中的（b）通过使用多位点Gateway1、参照PlatinumGateTALENAssemblyKit组装试剂盒的手册对TALECD的重复粒目的载体pDESTpK7WG2mit[0021]通过该反应，将入门载体1和3中的左右两个TALECD的ORF都被分别转移到含有CaMV35S启动子和拟南芥ATPaseδ亚基线粒体靶向信号的Ti质粒中。1、将青花菜种子消毒后播种于发芽培养基中，10天后在超净台中取其子叶切成8;;C,OstergaardL,etal.:Brassicarapa,WangK,edit