CN119492871A 用于改进测定的化合物、组合物和方法 （北卡罗来纳-查佩尔山大学）

201980036497.32019.09.24述检测试剂可包含分子识别元件(例如抗体)和的核酸序列的至少一部分和所述检测试剂的核2其中第一核酸序列的至少一部分和第二核酸序列的至少一部分配置成参与核酸扩增个构件)并且所述接头在所述固体支持物的表面上，任选地其中所述固体支持物用多个接3.任何一项前述权利要求的试剂盒，其中第一分子识别元件和/或第一核酸序列连接4.任何一项前述权利要求的试剂盒，其中所述接头为链霉亲8.任何一项前述权利要求的试剂盒，其中第二核酸序列包含选地其中与第一核酸序列中的序列基本上相同的所述序列存在于第二核酸序列的5'区域9.任何一项前述权利要求的试剂盒，其中第一核酸序列和/或第二核酸序列包含单链3本发明在美国国防部(UnitedStatesDepartmentofDefense)(DARPA)授予的批准号HR0011_12_2_0001的政府可直接检测的荧光染料。LuminexCorp.已将一种使用直接标记的受欢迎的免疫测定商业[0005]酶联免疫吸附测定(ELISA)为一种众所周知的免疫测定，其使用信号放大来提高4使用具有不同颜色探针组的多个独特标签序列来实现多重复用。体将不同编码的珠粒组功能化，使得可从光学信号同浓度的多种染料的荧光)解码结合于每个珠粒的捕获抗体的身份。可将不同组的珠粒混以去除样品基质，并然后用检测抗体进行标记[0010]如同上述数字ELISA一样，在数字iPCR测定中，将珠粒加载到单个反应孔中以将链DNA(dsDNA)插入染料或水解探针(例如Ta的百分比(即数字信号)可与Poisson统计一起用于物，并因此可使用模拟信号(例如实时PCR或对靶标分子整体的另一定量测量)确定每个珠异性结合(NSB)、与捕获抗体的相互作用或基于珠粒的免疫测定中与珠粒编码染料的相互5[0013]当单重测定被合并成多重小组(通常需要重新优化检测抗体浓度和其他测定参NSB事件对数字化测定的性能也可能有害。高灵敏度的多重测定一般地限于约5_10种不同[0015]除以上强调的问题之外，多重PCR还经常遭受序列外扩增以及引物和探针组之间本发明的方面涉及用于改进测定比如多重PCR测定(例如多重免疫PCR测定)的化物和检测试剂存在于相同的组合物中和/或一起第一多个固体支持物中的每个固体支持物包含：提供第一编码信号的第一编码剂(例如染二多个固体支持物中的每个固体支持物包含：提供第二编码信号的第二编码剂(例如染多种检测试剂中的每种检测试剂包含第一分子识别元件(例如抗体)和第一核酸序列；和其中用于第一核酸序列的第一部分的核酸序列不同于用于第二核酸序列的第一部分的核6二核酸序列并且第一核酸序列的至少一部分和第二核酸序列的至少一部分配置成参与核[0022]本发明的另一方面涉及提高测定的特异性和/或减少测定的背景信号的方法，所体支持物或多种固体支持物的情况下进行测定，从而提高测定的特异性和/或减少测定的或任何实施方案的特征。申请人保留更改任何初始提交的权利要求和/或相应地提交任何新权利要求的权利，包括能够修改任何初始提交的权利要求以从属于和/或并入任何其他说明书中详细解释本发明的这些和其他目的和/或方面。通过阅读附图和随后优选实施方[0026]图3为用单独的捕获抗体功能化的3个不同的编码珠粒组的示意图并且每个珠粒[0030]图7为通过用独特的染料或染料组合编码每组制备的珠粒组的示意图，并且根据[0031]图8为根据本发明的一些实施方案正确形成的实例复合物(即珠粒上的捕获抗体7[0037]图12提供将常规iPCR珠粒的阳性珠粒的百分比与根据本发明的一些实施方案制[0038]图13提供将常规iPCR检测试剂缀合物的活性与根据本发明的一些实施方案制备[0039]图14提供将使用常规iPCR系统在基线单重测定中用于各种靶标的阳性珠粒的百分比与使用本发明一些实施方案的系统用于相同靶标的阳性珠粒的百分比进行比较的图[0040]图15提供显示在三重iPCR测定中对于每种珠粒类型获得的信号的图表和比较不[0041]图16提供显示根据本发明的一些实施方案在三重测定中针对每种珠粒类型获得[0042]图17提供图15的三重iPCR测定的比较图表和图16的本发明一些实施方案的三重定义的那些术语，应解释为具有与其在本申请和相关技术的上下文中的含义一致的含义，8料或步骤“以及不实质上影响要求保护的发明的基本和新颖特征的那些”。参见Inre的非限制性实例和/或变体实施方案，并且不旨在表示与一个或多个其他实施方案相比较的那些碱基，并且化学修饰的碱基可提高测定(例如PCR反应)的特异性和/或减少其他RNA9胞苷的C_5丙炔类似物的多核苷酸以高亲和力结合RNA，并且为有效的基因表达反义抑制从左到至右的5'至3'方向呈现，并使用标准编码表示，该标准编码表示如美国序列规则37CFR§§1.821_1.825和世界知识产权组织(WorldIntellectualProperty本发明的这种核酸部分可在适当情况下包含在其作为组成部分的较大多核苷酸的任何部编辑)OxfordUniversityPress,NewYork(1988)；Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects(Smith,D.W.,编辑)AcademicPress,NewYork(1993)；ComputerAnalysisofSequenceData,PartI(Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,编辑)HumanaPress,NewJersey(1994)；SequenceAnalysisinMolecularBiology(vonHeinje,G.,编辑)AcademicPress(1987)；和SequenceAnaJ.,编辑)StocktonPress,酸或蛋白序列执行与其基本上相同的核苷酸或蛋白序列基本上相同工具比如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、泛指南参见TijssenLaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology_HybridizationwithNucleicAcidProbes第一部分第2章“Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassay”，的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃。[0069]Tm为50％的靶标序列杂交于完全匹配的探针的温度(在规定的离子强度和pH下有多于100个互补残基的互补核苷酸序列进行杂交的严格杂交条件的一个实例为50％甲酰胺和1mg肝素在42℃下进行杂交过夜。高度严格洗涤条件的一个实例为0.15MNaCl在72℃交测定中对不相关探针观察到的信噪比的2x(或更高)信噪比表明检测到特异[0070]以下为可用于克隆与本发明的参考核苷酸序列基本上相同的同源核苷酸序列的SDS洗涤。在另一个实施方案中，参考核苷酸序列在50℃下于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、[0073]本发明的实施方案可解决和/或减少测定(例如多重iPCR测定)中的一个或多个问如珠粒)的递送以形成空间多重PCR反应，其可避免与单一反应、多重PCR相关的常见复杂于提供核酸序列和分子识别元件和/或可偶联于编码剂(比如荧光化合物、化学发光化合与并且固体支持物(任选地包含一种或多种编码剂)上的分子识别元件可连接于样品的一一种或多种编码剂和/或编码的分子识别元件提供或结合到固体支持物上。在一些实施方产生等)固体支持物和/或固体支持物的材料和/或与固体支持物接触的材料缔合的一种或测的编码信号和/或一种或多种编码剂可为一种或多种编码剂连接的固体支持物的特定部[0080]编码信号可由与固体支持物缔合的一种或多种编码剂和/或由固体支持物本身[0081]相应固体支持物(可为其全部或一部分)的编码信号可为可检测的(例如可以光一些实施方案中，固体基底的编码信号可以变化和/或可通过其中存在固体支持物的环境度和同位素衰变引起的无线电发射以及上述的组合的变化子识别元件的样品)的不同群至少部分地基于来自编码的固体支持物和/或编码的分子识和/或固体支持物(例如微球)。物理和/或化学变化可为影响固体支持物的物理和/或化学变化(例如变化可为固体支持物的电荷和/或颜色的变化和/或可为固体支持物的大小和/或化学变化(例如变化可为使编码剂结合于[0084]固体支持物的编码可通过本领域技术人员已知的任何方法来实现(例如使用颜多个接头可将分子识别元件和/或核酸序列连接和/或结合(例如共价或非共价地)于固体是指可用于将一个组件(例如固体支持物)连接或结合于另一组件(例如分子识别元件)的因子和表皮生长因子受体、肿瘤坏死因子一α和肿瘤坏死因子受体以及干扰素和干扰素受及其受体，比如粒细胞_巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)和GMCSF受体以及巨噬细胞集落刺地高辛(NHS酯)、胆固醇_TEG、可从IntegratedDNATechnologiesInc.市售获得的I_LinkerTM、可从IntegratedDNATechnologies,Inc.市售获得的Uni_LinkTMAmino[0086]可使用任何合适的偶联化学将分子识别元件和/或核酸序列结合于固体支持物。分子识别元件或其一部分与固体支持物分开和/或使核酸序列或其一部分与固体支持物分尤其是如果水解探针或TaqMan探针用于检测化学时，因为即使dsDNA扩增子连接于珠粒仍[0089]在一些实施方案中，固体支持物包含多种接头和/或包被有一种或多种接头。例并且一种或多种生物素化的分子识别元件和/或一种或多种生物素化的核酸序列可经链霉分子识别元件和/或核酸序列。在一些实施方案中，固体支持物包含和/或结合量为约[0091]固体支持物可提供给测定和/或反应孔以约1nM一约1mM范围内的量存在的分子识识别元件和/或核酸序列的浓度可足以执行或进行扩增过程(例如PCR)和/中，核酸序列为寡核苷酸。在一些实施方案中，主要在固体支持物内部而不暴露在固体支持物的外部(其中可结合分子识别元件(例如捕[0094]存在于固体支持物上的引物可与防止杂交的化学物类(比如某些核酸序列(任选地带有修饰的碱基)，其解链温度高于检测试剂温育的温度但低于进行PCR的退火温度)缔[0095]在一些实施方案中，固体支持物包含衍生自一种或多种修饰的碱基比如可得自Firebird和其他来源的那些的自回避引物。在一些实施方案中，自回避分子识别系统[0096]本发明固体支持物上的正向引物和/或反向引物和/或本发明的检测试剂可配置合位点直至第一个PCR循环之后才存在，所以防止引步骤后引物变为单链。可设计引物使得双链结构(例如双[0097]在一些实施方案中，本发明的检测试剂可被保护和/或设计为最小化与固体支持同于第二核酸序列和/或第一分子识别元件不同于第二分子识别元件，所以第一多个固体支持物中的固体支持物区分和/或区别于第二多个固体支持物中酸序列中的至少约5个或更多个(例如持物的核酸序列基本上相同和/或核酸标签的3'区域中的序列与可任选地存在于PCR主混并且通过相应编码的珠粒的正向引物(任选地当[0103]对应于一个或多个固体支持物组中的固体支持物的检测试剂各自包含相同的核剂的核酸标签在5'区域中包含配置成参与用正向引物的至少一部分进行的核酸扩增过程标签的5'区域中的序列基本上相同。反向引物可与所有核酸标签的3'区域中的序列互补，[0104]在一些实施方案中，固体支持物的核酸序列和/或检测试剂的核酸标签包含单链在一些实施方案中，固体支持物的核酸序列和/或检测试剂的核酸标签包含RNA或杂交的多种化学修饰的碱基可提高PCR反应的特异性和/或减少核酸序列(例如寡核苷酸)之间的[0105]核酸标签可以任何方式连接或结合于分子识别元件和/或连接或结合于分子识别通过独特的反向引物扩增和另一个通过通用反向引[0112]可使用本领域技术人员已知的任何方法将核酸标签连接于分子识别元件以提供[0116]根据一些实施方案提供包含本文所述的固体支持物和/或本文所述的检测试剂的多种不同编码的固体支持物的多种固体支持物以及任选地包含两种或更多种不同的检测些实施方案中，可将与所有标签的保守的3'末端或区域互补的反向引物添加至PCR主混合正向引物A两者。珠粒组B将携带捕获抗体B和仅可扩增连接于检测抗体B的核酸标签B的正[0118]在一些实施方案中，本发明的固体支持物不包含可与核酸标签杂交的互补序数反应孔仅含有单个珠粒微孔阵列)中。可任选地在例如通过用不混溶的油密封而流体分离每个反应之前，添加含有与所有标签的3'末端或区域互补的共同反向引物的PCR主混合的引物不能扩增检测抗体缀合物B上的核酸标签(图8)。以这种方式，优化为单重反应的iPCR测定在多重时可能需要较少的重新优化，因为可通过每个珠粒组扩增和/或检测的总[0122]本发明的固体支持物及其相应的检测试剂可分开储存于本发明的组合物、试剂支持物的核酸序列的至少一部分配置成参与核酸扩增过程。核酸标签的至少一部分被扩进行一个或多个洗涤步骤以洗涤靶标结合的固体支持物和/或洗涤复合物。一个或多个洗涤步骤可去除未反应的和/或非结合的组分和/或非特异性地结合于复合物固体支持物、靶标和检测试剂的复合物合并和/或反应。在合并扩增剂和复合物的步骤之[0129]本发明的方法可包括扩增相同和/或不同的一个或多个核酸序列。在一些实施方一部分使用PCR进行。在一些实施方案中，扩增检测试剂的核酸标签的至少一部分不涉及[0130]在一些实施方案中，本发明的方法使用邻近连接测定(proximityligation测定)，并且所述方法进一步包括将固体支持物与一个或多个另外的固体支持物以及所述发明的固体支持物可在不混溶的油(比如乳液PCR、BioRadDigitalDropletPCR系统、RainDancePCR系统或称为BEaMing的技术中使用的那些)中的水性PCR主混合物的液滴中术可以乳液/液滴形式使用，或者如果扩增子保持连接于固体支持物则可以本体溶液的形如超顺磁性珠粒)将试剂和/或靶标递送到反应孔中的方法，比如例如在美国申请公开号2015/0211048和国际申请号PCT/US2016/042913中所述的，所述申请每一个的内容通过参列的测定，比如可重配置的多元件诊断(reconfigurablemulti_elementdiagnostic，ReMeDx)测定，紧凑阵列中的单重反应(singleplexreactionsinacompactarray，支持物可通过使固体支持物(任选地包含一个或多个接头)与分子识别元件和核酸序列同的分子识别元件和/或核酸序列的量和/或可助于减少测定期间的[0134]在一些实施方案中，可通过使用立足点置换引物(toe_holddisplacement体支持物的核酸序列(例如引物)的不期望的杂交。引物于检测试剂与连接于固体支持物的核酸序列的杂交，但是PCR扩增仍可随后在方法的检测[0136]可使用本领域技术人员已知的任何方法，比如通过视觉观察和/或化学或生化测[0138]本发明的方法可提高测定的特异性和/或可减少测定的背景信号。在一些实施方到的交叉反应性和/或背景信号，和/或减少观察到的交叉反应性和/或背景信号以进行多会表现出高水平交叉反应性的分子识别元件(例如抗体)对的能力可实现目前尚未实现的使用本文所述的固体支持物和检测试剂开发了单分子的基于珠粒的免技术可如何减少来自非特异性结合和抗体交用TriLinkBiotechnologiesProtein_OligoConjugationKit将相同的60ntssDNA标签[0145]通过将链霉亲和素包被的Dynabead与生物素化的捕获抗体一起温育来制备ProteinSiRCA珠粒(图10)。使用TriLinkBiotechnologiesChromalinkBiotinAntibodyLabelingKit在内部将抗体进行生物素化。然后将抗体标记的珠粒与生物素化[0146]在单重测定中，将ProteinSiRCA珠粒的阳性百分比与常规iPCR珠粒进行比较。iPCR珠粒与ProteinSiRCA珠粒的不同之处在于，iPCR珠粒未用链霉亲和素功能化或未包抗体缀合物一起温育(即所有检测缀合物均具有相同抗体缀合物活性的比较表明，所有ProteinSiRCA缀合物的灵敏度均低于iPCR缀合物(图这些无标签抗体可结合捕获的靶标分子，但不会产生可检ProteinSiRCA缀合物之间标记效率的差异很可能是由于缀合试剂盒(TriLinkBiotechnologiesProtein_OligoConjugationKit)中购买的抗体储备液或老化试剂的到的差异很可能是由于抗体缀合物制备中的可变性而不是ProteinSiRCA缀合物的固有特定(图14)。