CN119497756A 方法 （牛津大学创新有限公司）

2025.01.07PCT/GB2023/0512562023.05.12WO2023/218208EN2023.11.16括向细胞递送催化失活的Cas13(dCas13)蛋白和CRISPRRNA(crRNA)，其中crRNA将dCas13蛋白募21.一种调节靶RNA中调控元件的功能的方法，包括向细胞递送催化失活的Cas13蛋白PinCas13b、Cas13Y.1、Cas13Y.2、AdmCas13d、LbmCas13a、LbfCas13a、LbuCas13a、5.如前述权利要求任一所述的方法，其中相对于相应的未修饰的Cas13蛋白，所述dCas13蛋白包括在HEPN_1结构域的RxxxxH基序和HEPN_2结构域的RxxxxH基序中的一个或6.如前述权利要求任一所述的方法，其中所述dCas13蛋白包括与SEQIDNO:1具有≥85％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，条件是对应于SEQIDNO:1的第133和1058位氨8.如权利要求7所述的方法，其中所述dCas13蛋白包括与SEQIDNO:2或3具有≥85%序列同一性的氨基酸序列或由其组成，条件是对应于SEQIDNO:2或3的第133位氨基酸残9.如前述权利要求任一所述的方法，其中所述crRNA包括dCas13特异性直接重复和能(a)所述蛋白结合位点是重复扩增序列、开放阅读框的起始密码子、上游开放阅读框314.一种阻断miRNA结合位点的方法，包括根据权利要求1至12任一所述的方法调节靶16.一种诱导剪接转换的方法，包括根据权利要求1至12任一所述的方法调节靶RNA中序列特异性杂交并具有18至24个核苷酸条件是对应于SEQIDNO:2或3的第133位氨基酸残基19.一种编码根据权利要求17所述的crRNA或根据权利要求18所述的dCas13b蛋白的多20.一种递送媒介物，包括根据权利要求17所述的crRNA、根据权利要求18所述的22.根据权利要求17所述的crRNA或根据权利要求18所述的dCas13b蛋白，用于在人或23.根据权利要求17所述的crRNA，用于治扩增疾病为1型强直性肌营养不良(DM1)、224.一种治疗或预防受试者中的重复扩增疾病的方法，其中所述方法包括向受试者施调节核酸中调控元件的功能，或如权利要求13所述的方法调节目的核酸或蛋白质的可用扩增疾病为1型强直性肌营养不良(DM1)、2型强426.根据权利要求23所述的crRNA的用途、根据权件是对应于SEQIDNO:2或3的第133位氨基酸残基的氨基酸5[0002]RNA分子由调控元件组成，并且这些调控元件的功能可通过使用靶特异性基因调用。例如，ASO可用于诱导剪接转换、抑制翻译起始、干扰负调控翻译的上游开放阅读框肌营养不良症中的毒性RNA(参考文献1)Coxetal.(2017)在催化失活的PspCas13b和ADAR[0007]发明人鉴定出Psp_dCas13b是有效的空间位阻剂。当用crRNA编程以靶向RNA序列时，发明人发现Psp_dCas13b能够阻断靶RNA序列与核糖核蛋白复合物如核糖体和miRNA沉内皮营养不良)、miRNA失调在病理中起作用的疾病、翻译[0008]与设计困难且受高脱靶效应限制的小RNA和RNA干扰相比，CRISPR/dCas13可用于6dCas13b，以靶向在荧光报告转基因的3/UTR编码的三个不同的miRNA结合位点。在该试验个miRNA结合位点(图3A)。此外，发明人观察到，通过用Psp_疗由DMPK1基因的3/UTR的(CTG)n重复序列的扩展引起的RNA显性疾病1型强直性肌营养不接病变(图4A)。发明人发现，当Psp_dCas13b被编程为使用间隔区长度为21nt或24nt的[0013]发明人制备了截短形式的Psp_dCas13b，其不仅具有与全长形式相似的空间位阻效应，而且足够小以被单个AAV载体(例如AAV9载体)编码。特别是，发明人制备了Psp_dCas13b的两个C端截短的变体，并在荧光报1053个氨基酸残基之一[1053_aa]和长度为984个氨基酸残基之一[984_aa])与全长变体具和phU6驱动的靶向扩增(CTG)n重复序列的21nt间隔区crRNA。当注射到DM1小鼠模型中时，[0015]因此，本发明提供一种调节靶RNA中调控元件的功能的方法，包括将dCas13和[0018]本发明还提供了阻断核糖体附着或翻译的方法，包括根据本发明的方法调节靶活性，其中crRNA包括与开放阅读框的起始密码子或上游开放阅读框(uORF)的起始密码子7[0019]本发明还提供了诱导剪接转换的方法，包括根据本发明的方法调节靶RNA中调控能够与靶RNA序列特异性杂交并具有18至24个核苷[0021]本发明还提供了一种dCas13b蛋白，由与SEQIDNO:2或3具有≥85％序列同一性的氨基酸序列组成，条件是SEQIDNO:2或3的第133位氨基酸残基对应的氨基酸残基为丙[0022]本发明还提供了编码根据本发明的crRNA或根据本发明的dCas13b蛋白的多核苷受试者施用治疗有效量的dCas13蛋白和crRNA，其中所述方法包括根据本发明的方法调节可选地其中所述扩增疾病为1型强直性肌营养不向受试者施用治疗有效量的dCas13蛋白和crRNA，其中所述方法包括根据本发明的方法调[0030]本发明还提供根据本发明的crRNA或dCas13b蛋白在制备用于治疗重复扩增疾病8阻断实验中，dCas13直向同源物被相应的crRNA靶向以结合ECFP转录物的5′UTR或TSS(右的miR_17结合位点。ECFP的表达水平通过流式细胞术定量并相对于mIFP的表达水平标准[0032]图2显示缩短crRNA间隔区提高了Psp_dCas13b的空间位阻效应。ECFP的表达水平TSS的三种不同crRNA的间隔区长度的效果。18–24nt的较短间隔区序列表现出最有效的[0033]图3显示Psp_dCas13b能够完全和特异性地干扰miRNA功能。ECFP的表达水平通过UTR的靶位点。B)比较针对antagomiR_17的Psp_dCas13b介导的miRNA脱抑制的程度的图。[0034]图4显示在DM1细胞模型中Psp_dCas13b逆转病理剪接模式。Scr，加扰的非目标[0035]图5显示如RNaseq数据所示，在逆转DM1相关的误剪接方面Psp_dCas13b优于反义9C端截短变体的示意图。B)比较Psp_dCas13b全长变体和截短变体对crRNA间隔区长度的位区长度同样敏感。ECFP的表达水平通过流式细胞术定量并相对于mIFP的表达水平标准化。[0037]图7显示用Psp_dCas13b处理HSA_LRDM1小鼠模型的成年骨骼肌校正了剪接失[0040]SEQIDNO:2显示长度为984个氨基酸残基(984_aa)的Psp_dCas13b的C端截短变[0041]SEQIDNO:3显示长度为1053个氨基酸残基的Psp_dCas13b的C端截短变体的多肽[0042]SEQIDNO:4显[0053]虽然不希望受理论的束缚，dCas13被募集到RNA分子中的靶位点，如通过[0054]已知Cas13蛋白仅包括单个多结构域效应物(II类)和靶RNA(VI型)，并且Cas13蛋[0056]天然存在的Cas13蛋白具有良好的哺乳动物细胞相容性和对其靶RNA序列的高结力(KD)可通过本领域已知的任何合适的方法，例如ELISA或表面等离子体共振，来分析。Cas13蛋白的核酸酶活性可于荧光报告分子试验中测定，例如ECFP/mIFP双向报告分子试将荧光报告分子的表达降低至少25％的Cas13蛋白特别有用于[0057]可用于本发明的Cas13蛋白可为Cas13b、Cas13A、Cas13d、Cas13X、Cas13Y或RcsCas13a、RcrCas13a、RcdCas13a、LbuCas13a、HheCas13a、LspCas13a、BzoCas13b、PinCas13b、PbuCas13b、PsmCas13b、RanCas13b、PauCas13b、Pin2Cas13b、PguCas13b、PgiCas13b、Pin3Cas13b、Cas13bt1、Cas13bt3、FnbCas13c、AspCas13c、UrCas13d、RcsCas13a、RcrCas13a、RcdCas13a、LbuCas13a、HheCas13a、LspCas13a、BzoCas13b、PinCas13b、PbuCas13b、PsmCas13b、RanCas13b、PauCas13b、Pin2Cas13b、PguCas13b、PgiCas13b、Pin3Cas13b、Cas13bt1、Cas13bt3、FnbCas13c、AspCas13c、UrCas13d、[0061]Cas13蛋白可为Cas13b家族的成员，即Cas13b蛋白。Cas13b蛋白于本发明特别有[0063]Cas13蛋白可不为Cas13a蛋白。例如，Cas13蛋白可不为LshCas13a(WP_[0065]天然存在的Cas13蛋白可通过突变负责核糖核酸酶活性的两个HEPNRNA酶结构域的RxxxxxH基序(其中x为任何氨基酸)中的一个或多个氨基酸残基来修饰以失活其核糖核括相对于野生型在HEPN_1结构域的RxxxxH基序中和相对于野生型在HEPN_2结构域的[0067]可用于本发明的dCas13可包括与SEQIDNO:1具有≥8可用于本发明的dCas13可包括与SEQIDNO:1具有≥85％、≥90％、≥95％、≥96％、≥NO:1的第133和1058位氨基酸残基相对应的氨基酸残基发生突变。可用于本发明的dCas13100％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成，条件是与SEQIDNO:1的第133和1058位氨4.7kb)除了表达盒中的其它必需元件之外，其包含编码全长dCas13蛋白的核酸序列(长度短的dCas13蛋白保留了其对靶RNA序列的结合亲和力和其阻断活性。截短的dCas13蛋白可[0073]dCas13蛋白可缺乏完整的HEPN_2结构域。dCas13蛋白可基本上缺乏HEPN_2结构域。给定Cas13蛋白或直向同源物中的HEPN_2结构域的位置和长度可于截短之前使用本领小的影响的修饰蛋白质。因此，截短的dCas13蛋白的Cas13蛋白可为Cas13b家族的成员。Cas13蛋白可为Psp_Cas13b、Bzo_Cas13b、Pin_Cas13b、Pbu_Cas13b、Asp_Cas13b、Psm_酸序列或由其组成，条件是对应于SEQIDNO:2或3的第133位氨基酸残基的氨基酸残基为基酸残基中的一个或多个发生突变，并且对应于SEQIDNO:1的第1054至1058位氨基酸残基的氨基酸残基中的一个或多个发生突变；(b)对应于SEQIDNO:1的第133和1058位氨基酸残基的氨基酸残基为丙氨酸；(c)对应于第128至132位氨基酸残基的一个或多个氨基酸签，例如对应于人流感血凝素的氨基酸98至[0084]可用于本发明的CRISPRRNA(crRNA)包括dCas13特异性直接重复和能够与靶RNA述的dCas13蛋白，并将其募集到RNA分子中的靶位点，如通过间隔区所确定的。这促进纵子中的序列重复的生物信息学分析，以及通过Cas13蛋白与推测的侧翼为直接重复序列的靶序列的实验性结合研究，可以鉴定与各种细菌物种的Cas13蛋白一起起作用的直接重优势的，因其可增加与crRNA蛋白相互作用的dCas13蛋白例如dCas13b蛋白的空间位阻效[0094]这种提高的位阻效应可能是由于dCas13与靶RNA序列提高的结合亲和力。不希望近的结构研究显示crRNA通过进入HEPN1和螺旋一2结构域之间的中央通道与Cas13b蛋白杂部分和/或至少一个修饰的核碱基部分)和/或至少一个修饰的核苷间键。可以修饰crRNA，[0100]本发明涉及靶RNA中的任何调控元件，其中所述调控元件调控目的基因的表达或(aRNA)、长非编码RNA(IncRNA)、假基因、环状RNA(环状RNA)、长基因间非编码RNAJPH2mRNA3′UTR中的(CTG)n、C9orf72mRNA内含子中的(GGGGCC)n、FMR15′如参见SEQIDNO:4和7至11中所示核苷酸可包括编码本文所述的dCas13蛋白和crRNA的序列。编码dCas13蛋白和/或crRNA的蛋白或crRNA的序列可以进一步可操作地连接到编码一个或多个报告基因的序列。合适的[0116]本文所述的dCas13蛋白和crRNA被递送至细胞。dCas13蛋白可以以蛋白或多核苷[0123]药物组合物可包括一种或多种组织特异性递送分子，其设计成将本文所述的相容性聚合物形成的微胶囊中或在根据本领域已知方法的脂[0132]本发明的方法和用途可包括通过调节靶RNA中调控元件的功能来调控(例如，增中调控元件的功能，或根据本发明的方法调节目的核酸或蛋白质的可用性、表达和/或活性，其中crRNA包括与开放阅读框的起始密码子或上游开放阅读框(uORF)的起始密码子互蛋白或crRNA接触的细胞中核酸或蛋白质的利用度相比，例如通过核酸或蛋白质的未结合蛋白或crRNA接触的细胞中核酸或蛋白质的利用度相比，例如通过核酸或蛋白质的未结合蛋白或crRNA接触的细胞中核酸或蛋白质的利用度相比，例如通过核酸或蛋白质的未结合[0141]在本发明中核酸或蛋白质的表达和/或活性增加的实施方式中，与未与本文所述的dCas13蛋白或crRNA接触的细胞中的表达和/或活性相比，所述表达和/或活性可增加≥[0142]在本发明中核酸或蛋白质的表达和/或活性降低的实施方式中，与未与本文所述的dCas13蛋白或crRNA接触的细胞中的表达和/或活性相比，所述表达和/或活性可降低≥[0143]在本发明中核酸或蛋白质的表达和/或活性恢复的实施方式中，与未与本文所述的dCas13蛋白或crRNA接触的细胞中的表达和/或活性相比，所述表达和/或活性可恢复≥[0144]本发明的方法和用途可包含测定以下的步骤：(i)所述靶RNA的表达和/或活性水[0146]本发明的方法和用途可包括抑制疾病状态，例如阻止其发展；和/或缓解疾病状[0154]适用于本发明的剂量和剂量方案可在负责施用组合物的执业医师的正常技能内[0156]例如，编码dCas13蛋白的多核苷酸和本文描述的crRNA可通过肌内注射或血管内核苷酸和本文所述的crRNA在病毒载体(例如AAV9)中递送的实施方式中，病毒载体可以以[0157]RNA递送是体内递送的有用方法。编码dCas13的RNA和本文所述的crRNA可用脂质[0158]本发明的方法和用途可涉及治疗或预防重复扩增疾病(例如I型强直性肌营养不性/RBP募集/RAN翻译在疾病病理学中起到一些作用。发明人已证明，Psp_dCas13b可用crRNA编程以在转录后水平上靶向和空间阻断扩展的CTG重复。这导致参与剪接的RBP去募集，并随后逆转在DM1患者来源的细胞和DM1小鼠模型的细胞中观察到的剪接病变。基于法的药物中的用途，其中所述方法包括向受试者施用治疗有效量的所述dCas13蛋白和中所列基因的靶RNA中重复扩增序列互补的强直性肌营养不良、福斯氏角膜内皮营养不良、2型强直性肌营养不良、亨廷顿病样2、性共济失调，包括向受试者施用治疗有效量的dCas13b蛋白(例如Psp_[0167]所述重复扩增疾病可为I型强直性肌营养不良(DM1)，所述重复扩增序列可为[0168]因此，本发明提供一种治疗或预防DM1的方法，包括向受试者施用治疗有效量的dCas13b，如Psp_dCas13b)和crRNA，其制备用于治疗或预防DM1的方法的药物中的用途，其中所述方法包括向受试者施用治疗有crRNA包括与DMPK1中的重复扩增序列(CTG)n互补[0174]先前已经报道了几种miRNA靶向的治疗剂(antimiRs)已经达到临床开发，包含靶向miR_122的短反义寡核苷酸，其达到了治疗丙型肝炎的II期试验。本文描述的dCas13和miRNA结合位点来阻止miRNA与其结合位点之间的相互作用，所以与miRNA靶向治疗相比能中所述方法包括向受试者施用治疗有效量的dCas13蛋白(例如，dCas13b蛋白，如Psp_如Psp_dCas13b)在制备用于治疗或预防miRNA失调相关疾病的方法的药物中的用途，其中所述方法包括向受试者施用治疗有效量的所述dCas13蛋白(例如dCas13b蛋白，如Psp_dCas13b)和crRNA。本发明还提供本文所述的crRNA在制备用于治疗或预防miRNA失调相关疾病的方法的药物中的用途，其中所述方法包括向受试者施用治疗有效量的dCas13蛋白括结合miRNA邻近序列以破坏miRNA结合位点[0176]miRNA失调相关疾病可为丙型肝炎(dCas13蛋白可通过阻断miR122::HCV相互作用癌(dCas13蛋白可通过阻断miR21::PDCD4和miR21::PTEN用于治疗乳腺癌)和心力衰竭[0178]本发明的方法和用途可涉及治疗或预防翻译失调相关疾病和/或治疗或预防抑制翻译可治疗疾病。发明人已证明，Psp_dCas13b可用于在人细胞中阻断荧光报告蛋白的翻[0179]因此，本发明提供一种治疗或预防翻译失调相关疾病和/或治疗或预防抑制翻译译失调相关疾病和/或治疗或预防抑制翻译可治疗疾病的方法中，其中所述方法包括向受可治疗疾病的方法中，其中所述方法包括向受试者施用治疗有效量的dCas13蛋白(例如，(例如dCas13b蛋白，如Psp_dCas13b)在制备用于治疗或预防翻译失调相关疾病和/或治疗文所述的crRNA在制备用于治疗或预防翻译失调相关疾病和/或治疗或预防抑制翻译可治[0182]本发明的方法和用途可涉及治疗或预防异常剪接相关疾病和/或治疗或预防调节[0183]发明人已证明，Psp_dCas13b可用crRNA编程以靶向特定的RNA序列并在空间上阻合蛋白和/或核糖核蛋白复合物之间的相互[0185]因此，本发明提供一种治疗或预防异常剪接相关疾病和/或治疗或预防调节剪接接异常相关疾病和/或治疗或预防调节剪接可治疗疾病的方法中，其中所述方法包括向受可治疗疾病的方法中，其中所述方法包括向受试者施用治疗有效量的dCas13蛋白(例如(例如dCas13b蛋白，如Psp_dCas13b)在制备用于治疗或预防剪接异常相关疾病的方法和/供本文所述的crRNA在制备用于治疗或预防剪接异常相关疾病和/或治疗或预防调节剪接[0187]本发明还提供用于本发明的试剂盒和制品。试剂盒可包括本文所述的dCas13蛋剂盒可还包括一种或多种另外的试剂，例如dCas13蛋白的组成和递送所必需的缓冲液、[0199](b)PspCas13b、PguCas13b、PgiCas13b、Cas13X.1、Cas13X.2、PinCas13b、dCas13蛋白包括在HEPN_1结构域的RxxxxH基序和HEPN_2结构域的RxxxxH基序中的一个或从C端截短≤110个氨基酸残基，且可选地其中所述dCas13蛋白的所述Cas13蛋白是Cas13b85％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，条件是对应于SEQIDNO:2或3的第133位氨基[0207]11.如实施方式10所述的方法，其中所述crR[0209]13.一种阻断miRNA结合位点的方法，包[0210]14.一种阻断靶RNA的核糖体附着或[0211]15.一种诱导剪接转换的方法，包括如实施方靶RNA序列特异性杂交并具有18至24个核苷酸之间[0214]18.一种编码根据实施方式16所述的crRNA或根据实施方式17所述的dCas13b蛋白[0217]21.根据实施方式16所述的crRNA或根据实施方式1所述扩增疾病为1型强直性肌营养不良(DM1)、[0219]23.一种治疗或预防受试者中的重所述扩增疾病为1型强直性肌营养不良(DM1)、所述扩增疾病为1型强直性肌营养不良(DM1)、[0221]25.如实施方式22所用的crRNA、如实施方式23的方法或如实施方式24所用的NO:2或3具有≥85％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，条件是对应于SEQIDNO:2或3的。二个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数目的函数(即同一性相比，所述算法已被并入AccelrysGCG软件包(可在/Products/[0237]所有crRNA编码载体都是通过将两个单链寡核苷酸退火并将所得双链寡核苷酸连1×T4DNA连接酶缓冲液和五单位T4多核苷酸激酶的10μL在37℃温中。然后将细胞在37℃,5％CO2孵育24小时。然后除去转染培养基，并用新鲜DMEM+10%使用488nm激发和530/30带通滤波器测量EGFP。使用640nm激发和670/14带通滤波器测量mIFP。[0244]首先，使用0.05％胰蛋白酶－EDTA收获人成肌细胞，并根据制造商的说明书用的细胞铺板并培养使成肌细胞可分化成肌管。悬浮液通过70μm细胞过滤器。使用BDFACSAriaTM融合细胞分选仪进行细胞分选实验。在405nm激发后以450/50带通滤波器测量DAPI。使用488nm激发和530/30带通滤波器测量用1μL的cDNA制剂进行半定量PCR分析。然后将1–10μL的PCR产物在2％扣除，并测量每个样品的上带和下带密度。然后，计算外显子跳跃事件的相对包含水平[0250]在VectorBuilder合成编码全长Psp_dCas13b及其23nt的crRNA、截短的Psp_或具有>200个重复的HSALR转基因小鼠。对于TA注射，将含有全长Psp_dCas13b及其23nt的丙氨酸取代LwaCas13a的两个RxxxxH基序的精氨酸残基，设计催化失活的LwaCas13a(Lwa_活的PspCas13b(Psp_dCas13b)。通过用丙氨酸取代RfxCas13d的RxxxxH基序的第一个和最[0255]Lwa_dCas13a、Psp_dCas13b和Rfx_dCas13d分别克隆入含有编码N端核输出信号的miRNA位阻效应，将miR_17结合位点克隆在ECFP转基因的3/UTR，这使得miR_17诱导的ECFP相对于mIFP下调。然后使用它们相应的crRNA对dCas13蛋白编程，以结合和空间阻断物之间的相互作用介导的，而不是crRNA:mRNA杂交，发明人进行了省略了Psp_dCas13b或crRNA的荧光报告实验。实验的结果表明Psp_dCas13b和crRNA都是阻断ECFP翻译所必需的察到去抑制。同时，当包括与miRNA结合位点的邻近区域互补的间隔区的crRNA靶向Psp_[0266]发明人通过比较相对ECFP表达水平与miRNA阻断反义寡核苷酸(antagomiR)处理导致miRNA活性针对ECFPmRNA的完疗RNA显性疾病的效用。1型强直性肌营养不良(DM1)是由DMPK1基因的3/UTR的(CTG)n重复[0270]发明人假设Psp_dCas13b可通过空间阻断DMPK1mRNA中的毒性重复序列，从而使发明人用编码NLS_dCas13b_NLS_P2A_EGFP及其相应crRNAs的piggyBac质粒电穿孔野生型[0271]发明人进一步比较了dCas13系统实现的病理剪接的逆转程度和反义寡核苷酸苷酸。特别是，用Psp_dCas13b/crRNA3处理DM1患者来源的成肌细胞的Psp_dCas13b/[0274]为了进一步研究Psp_dCas13b作为治疗形式的效用，发明人试图将AAV9编码的dCas13b的表达模式留下了很少的空间。为了解决这个重要问题，发明人设计了Psp_酸残基[1053_aa]、一个长度为984个氨基酸残基[984_aa])对全长变体的间隔区长度具有[0279]发明人在用pEFS驱动的全长Psp_dCas13b注射的小鼠中观察到Atp2a1、Mbnl1、Clcn1和Ldb3转录物的剪接失调的适度逆转。发明人还观察到，pCMV驱动的mini_Psp_dCas13b导致Mbnl1转录物的剪接去调控的逆转强于pEFS驱动的全长Psp_dCas13b(图7B)，这可能反映了由CMV启动子驱动的mini_Psp_dCas13b的表[0283]鉴于Psp_dCas13b可以逆转DM1小鼠模型中的剪接失调，预计Psp_dCas13b也可用[0285]为了研究Psp_dCas13b逆转DM2中剪接失调的能力，可以射1×1010至1×1012个治疗或对照AAV9载体的载体基因组(vg)来进行实验。然后可于注射[0286]然后可以收集来自样品的总RNA，并用RT_PCR评估生物标志物如CLCN1、INSR、[0290]已经发现Psp_dCas13b在空间上阻断靶RNA序列与核糖核蛋白复合物包含核糖体[0292]为了研究Psp_dCas13b促进SMN2外显子7保留的能力，可以生源于注射治疗性载体的小鼠的样品将显示一[0294]编码Psp_dCas13b和cRNA的治疗载体比FDA批准的反[0296]Psp_dCas13b可在福斯氏角膜内皮营养不良(FECD)的细胞模型中逆转RNA结合蛋增厚、和胞外基质以牙槽形式的沉积。它是由TCF4基因内含子3中(CTG)n重复的扩展引起[0299]为了研究Psp_dCas13b逆转FECD中RBP募集的能力，可以(1)pCMV驱动的mini_Psp_dCas13b；和(2)phU6驱动的含有24nt的CCTG重复的cr[0303]3Emericetal.,bi[0305]5Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,CSHPress1989,pp.15.3_15.108.[0306]6Konermannetal.,[0310]10Ausubel(ed),WileyInterscience,NewYorkandtheManiatisManualproducedbyColdSp疾病宿主基因重复基序位置实例crRNA间隔区序列1型强直性肌营养不良DMPKCTG5′GCAGCAGCAGCAGCAGCAGCA_3′(SEQIDNO:73)福斯氏角膜内皮营养不良TCF4CTG内含子5′GCAGCAGCAGCAGCAGCAGCA_3′(SEQIDNO:73)2型强直性肌营养不良CNBPCCTG内含子5′GCAGGCAGGCAGGCAGGCAGG_3′(SEQIDNO:74)亨廷顿病样2JPH3CTG5′GCAGCAGCAGCAGCAGCAGCA_3′(SEQIDNO:75)C9orf72肌萎缩侧索硬化和/或额颞叶痴呆C9orf72GGGGCC内含子5′GGCCCCGGCCCCGGCCCCGGCC_3′(SEQIDNO:76)脆性X相关震颤/共济失调综合征FMR1CGG5′GCCGCCGCCGCCGCCGCCGCC_3′(SEQIDNO:77)脆性X相关原发性卵巢功能不全FMR1CGG5′GCCGCCGCCGCCGCCGCCGCC_3′(SEQIDNO:77)36型脊髓小脑性共济失调NOP56GGCCTG内含子5′GCCCAGGCCCAGGCCCAGGCC_3′(SEQIDNO:78)31型脊髓小脑性共济失调BEAN1/TK2bTGGAA/TTCCA内含子5′GTTAGGTTAGGTTAGGTTAGG_3′(SEQIDNO:79)10型脊髓小脑性共济失调ATXN10ATTCT内含子5′GAATAGAATAGAATAGAATAG_3′(SEQIDNO:80)[0326]SEQIDNO:2——长度为984个氨基酸残基(984_aa)的Psp_dCas13bC端截短变体[0328]SEQIDNO:3——长度为1053个氨基酸残基(1053_aa)的Psp_dCas13b的C端截短[0333]AAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCCGGATCCAAACACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTACCTGTCAGCTAGCACTCACGTGCTACCCCCTACACATTGATC[0337]GGAGACGAATAACGTTATATCCTGATTCACGTAATATCGTCTCAGUUGUGGAAGGUCCAGUUUUAGGGG[0338]SEQ