CN119497758A 用于对细胞或细胞器进行空间示踪和测序的方法 （巴黎科学与文学联大）

2025.01.03PCT/EP2023/0692822023.07.12WO2024/013218EN2024.01.18用于对细胞或细胞器进行空间示踪和测序本发明涉及一种在生物样品上或生物样品标签分配到包含单个或多个细胞或细胞器例如2d)释放多个核酸分子，所述多个核酸分子是所述发射e)解离所述生物样品并回收个体化细胞或细2.根据权利要求1所述的方法，其中每个发射体核酸与细胞靶标或细胞器靶标的配体4.根据权利要求1至3所述的方法，其中所述发射体核酸另外5.根据权利要求1至3所述的方法，其中以发射体(a)通过滚环复制产生的发射体核酸的多联体，其中每个多联体包含相同的发射体核7.根据权利要求5或6所述的方法，其中在步所述发射体核酸以释放所述发射的核酸的多个8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所在于所述生物样品中的所有或大部分所述细胞或所述细胞的任何细胞器的表面处或内部10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中在步骤d)之前或步骤e)之前通过显a)提供如能够通过根据权利要求1至10中任一项所述的方法获得的用(i)包含扩增序3b)将用所述核酸或其反向互补序列标记的所述个体化细中所述区室包含区室特异性核酸以及用于核酸标记和进一步测序的以下序列中的至少一d)裂解所捕集的细胞，或细胞和细胞器，从而在所述e)将i)区室特异性序列与ii)在所述区室中从所述细胞或细胞器释放的所述核酸和g)将包含相同区室特异性序列的核酸定义为源自相同生的所述核酸中含有的所述鉴定序列或其反向互补序列来映射所述单细胞最初在所述生h)通过确定在步骤e)中产生的所述核酸中含有的相同鉴定序列或其反向互补序列的12.根据权利要求11所述的进行映射和测序的方法，其中所述区室是液滴、水凝胶基13.根据权利要求11至12中任一项所述的进行映射和测序的方法，其中所述区室中包14.根据权利要求11至13中任一项所述的进行映射和测序的方法，其中步骤e)包括以ii)通过互补性将所述区室特异性核酸杂交至从所述细胞或细胞器释放的核酸，并使用DNA聚合酶延伸杂交至所释放的核酸的所述区室特异性核酸，以产生具有缔合的区室特iii)通过互补性将所述区室特异性核酸杂交至由来自所述细胞或细胞器的RNA的逆转生具有缔合的区室特异性序列的所述区室特异性列的所述核酸中或其反向互补核酸中的全部或部分所述扩增序列或捕获序列互补的引物步骤e)另外包括将所述区室特异性核酸杂交至存在于包含所述扩增序列、所述鉴定4序列和所述捕获序列的所述核酸中或其反向互补核酸中的全部或部分所述扩增序列或捕b)受体核酸，其中每个受体核酸包含i)与发射体核酸集合的全部或5许将鉴定标签分配到包含单个或多个细胞或细胞器例如约2个至10个细胞的生物样品的区化学、原位RNA杂交)和细胞数量(例如激光捕获显微切FieldofView_SpatiallyResolvedTranscriptomicsatNanoscaleResolution》组织中的表达，具有短读数(30个碱基)并且每个细胞仅具有约200个mRNA读数(与scRNA_seq中的约40,000个相比)。数字空间轮廓仪(DSP)是由Nanostring基于对通过UV暴露从靶是有限的，因为它们仅允许对来自大量细胞的有限数量的分子靶标的信号进行空间定位，6[0008]本发明提供的方法和试剂盒满足了对允许以几十个细胞或更少细胞的空间分辨[0009]本发明涉及一种用于用鉴定核酸序列来标记生物样品内的各个细胞或细胞器的所述受体核酸标记所述生物样品内的各个细[0013]d)释放多个核酸分子，所述多个核酸分子是所述发射体核酸的包含所述扩增序[0016]a)提供如能够通过根据本发明的用于标记各个细胞或细胞器的方法获得的用(i)[0017]b)将用所述核酸或其反向互补序列标记的所述个体化细胞或细胞器捕集在区室[0020]e)将i)区室特异性序列与ii)在所述区室中从所述细胞或细胞器释放的所述核酸7中产生的所述核酸中含有的所述鉴定序列或其反向互补序列来映射所述单细胞最初在所[0023]h)通过确定在步骤e)中产生的所述核酸中含有的相同鉴定序列或其反向互补序例如约2个至10个细胞的生物样品(诸如组织切片)的区域来分配鉴定核酸的解决方案。由于携带相同鉴定核酸的细胞在相同区域中，其允许在生物样品解离后相邻细胞的网络重成相同核酸的多联体，之后使其与具有限制性内切核酸酶的生物样品接触以破坏多联体。8[0038]发射体核酸集合的至少部分核酸分子与其他核酸分子的不同之处至少在于鉴定CTCTAATCCTGC(SEQIDNO:2)或由其组成，其中加下[0047]根据该方法的第二实施方案，以发射体核酸的群组的形9[0051]受体核酸被设计为包含i)与发射体核酸集合的全部或部分扩增序列匹配的扩增[0053]根据一些实施方案，受体核酸还包含限制性位点(用于内切核酸酶)或切割位点AACACCAAACCCTTCTAAAGCCCAAACCTC(SEQIDNO:3，即可包含序列SEQIDNO:2的发射体核[0067]根据该方法的其中每个发射体核酸与细胞靶标或细胞器靶标的配体结合的第一切口内切核酸酶和具有链置换活性的聚合酶添加至包含发射体核酸集合和受体核酸集合[0069]根据该方法的其中以具有相同鉴定序列的发射体核酸的群组的形式提供发射体内切核酸酶和聚合酶或(ii)限制性内切核酸酶(视情况而定)一起在25℃与37℃之间温育[0074]生物样品的图像可在步骤d)之前或步骤e)之前或在步骤d)与步骤e)之间通过显[0078]如能够通过或通过上述对各个细胞或细胞器进行映射的方法获得的用发射的核射和测序的方法包括实施本发明的标记方法以提供用发射的核酸标记的个体化细胞或细[0079]进行映射和测序的方法(还)包括将用发射的核酸标记的个体化细胞捕集在区室地，它是含有杂交至所捕集的细胞或细胞器释放的核酸的区室特异性序列的引物的恒定胞或细胞器与多个条形码单元接触以形成生物单元/条形码单元复合物，并且使所述生物单元/条形码单元复合物与水凝胶溶液接触，然后使所述水凝胶溶液聚合以将所述生物单个所述生物单元/条形码单元复合物包含独特的条形码。适合于形成水凝胶基质的水凝胶该方法包括使用光学检测，诸如通过成像(包括荧光成像)或荧光检测来分析所捕获的细SDS或TritonX_100的溶液注入区室中以通过渗透压休克裂解[0090]该方法还包括将i)区室特异性核酸与ii)在区室中从细胞或细胞器释放的核酸缔[0093]iii)通过互补性将区室特异性核酸杂交至由来自细胞或细胞器的RNA的逆转录产[0096]从细胞或细胞器释放的区室特异性序列和/或核酸进一步与包含扩增序列、鉴定核酸杂交至存在于发射的核酸中的全部或部分扩增序列或捕获序列，并使用DNA聚合酶延伸一条或两条杂交的DNA链，以产生包含鉴定序列或其反向互补序列以及区室特异性序列酸与存在于发射核酸中的全部或部分扩增序[0097]然后回收并测序由i)区室特异性核酸与ii)在区室中从细胞或细胞器释放的核酸样品中/上的位置的映射是基于由此产生的核酸中含有的鉴定序列或其反向互补序列，从含有的多个细胞或细胞器)最初在生物样品上的位置的映射是通过确定包含在步骤e)中产生的核酸的相同鉴定序列或其反向互补序列的相对比例以根据三角测量的原理估计细胞[0104]多个核酸(22)，所述多个核酸接枝在所述第一基板(14)上或所述第二基板(20)可致动水凝胶能够在收缩状态与溶胀状态之间溶胀，在所述溶胀状态下，所述封闭图案个笼状物由封闭图案制成的侧壁和由第一基板和第二基板构成些中间构造通常可用于允许流体而非细胞的[0114]微流体设备可以等效地包括两个单层壁、两个多层壁或一个单层壁和一个多层用选自氢氧化物基团、硅烷醇基以及它们的混合物的化学基团(优选硅烷醇基)进行官能[0121]根据一个优选的实施方案，第一壁由结构化和/或官能化的聚二甲基硅氧烷基板更优选25℃至40℃。[0145]根据第一变型，水凝胶的临界溶解温度(CST)是下临界溶解温度(LCST)。在高于[0146]根据第二变型，水凝胶的临界溶解温度(CST)是上临界溶解温度(UCST)。在高于[0152]水凝胶的总体行为(UCST和/或LCST行为)取决于水凝胶中存在的不同聚合物的性每个核酸包含编码核酸在所述第一基板或所述第二基板上的位置的定序列互补的序列。包含与所有或部分恒定序列互补的序列的一个或多个不同DNA可与接下出版物：VigneswaranN.等人，2017,Microfluidichydrodynamictrappingforsinglecellanalysis:mechanisms,methodsandapplications,Anal.Methods,9,3751_[0200]5)通过在第一基板与第二基板之间放置封闭图案和核酸来定位第一基板和第二[0204]根据一个特定的实施方案，第一基板和封闭图案在一个且唯一的步骤中一起制Macron,J.,Mai,T.Q.,Tabeling,P.和Tran,attachedmultiresponsivepolymernetworks.ACSappliedmaterials&interfaces,8[0210]核酸的接枝通常通过定点或原位光引导合成来进行，分别详述于以下文献中：DeRisi,J.等人.UseofacDNAmicroarraytoanalysegeneexpression.Nat.Genet14,457–460(1996)；以及Fodor,S.P.等人.Light_directed,spatiallyaddressableparallelchemicalsynthesis.Science(80_)该实施方案，通过将负压施加到围绕主设计的外部微流体通道中来进行设备表面上的压[0223]_在步骤1)与步骤2)之间，对第一基板的表面进行结构化和/或官能化的中间步[0224]_在步骤3)与步骤4)之间，对第二基板的表面进行结构化和/或官能化的中间步[0225]当基板由水凝胶制成时，基板的官能化通常可遵循Y.,2016.Tailoringpatternsofsurface_attachedmultiresponsivepolymer[0226]如果结构并非由水凝胶制成，则通常可以按照以下文献中详述的方案进行官能化：Beal,JohnHL等人“Arapid,inexpensivesurfacetreatmentforenhanced[0227]当基板由水凝胶制成时，基板的结构化通常可遵循Y.,2016.Tailoringpatternsofsurface_attachedmultiresponsivepolymer[0232]a)在第一基板(14)的表面上和/或在第二基板(20)的表面上(直接)接枝多个配[0233]b)在第一基板(14)的表面上和/或在第二基板(20)的表面上(间接)接枝多个配[0238]步骤i)可以在封闭图案(16)的接枝之前或之后、核酸(22)的接枝之前或之后进[0244]4)通过切割(例如通过光切割或由内切核酸酶催化的切割)从第一基板或第二基[0245]在一些实施方案中，杂交DNA与接枝核酸一起形成含有用于内切核酸酶的限制性成像的表型信息与针对单细胞或细胞器(或针对例如相互作用的两个或更多个细胞)的组[0250]a)提供微流体设备和如能够通过或通过本发明的对各个细胞或细胞器进行映射的方法获得的用包含鉴定序列(或其反向互补序列)的发射的核酸标记的细胞或细胞器的胞或细胞器在区室中与共同的标记核酸序列或与多个不同的标[0255]f)任选地在所述笼状物中从所述微流体设备的所述第一基板或所述第二基板的[0257]h)将区室特异性核酸的条形码与所释放的细胞或细胞器核酸和/或发射的核酸序[0263]在步骤c)中，在水凝胶处于收缩状态的条件下将悬浮液形式的用包含鉴定序列(或其互补序列)的发射的核酸标记的细胞或细胞器注射到微流体设备中通常通过以下方(PNIPAM)或由其组成的温度响应型水凝胶，可设定为≤28℃,其中水凝胶完全膨胀(D'Eramo等人，Microsystems&Nanoengineering[0267]e1)将由所捕获的细胞或细胞器分泌或释放的一种或多种分析物与直接或间接地接枝到第一基板(14)的表面上和/或第二基板(20)的表面[0268]e2)通过与特异于所结合的一种或多种分析物的经标记的第二配体或经标记的配述配体鉴定核酸的序列允许鉴定配体和结合至接枝配体的一种或多步骤f)或步骤j)中的接枝核酸的释放。DNA_工具箱反应的原理描述于例如国际专利申请WO2017141068和WO2017141067由本领域技术人员通过在微流体设备中循环低渗或高渗水相而容易地实施。对于该操作，至所释放的细胞或细胞器核酸和/或至发射的核酸序列，该区室特异性核酸可以仍然接枝于微流体设备的第一基板或第二基板的表面或从微流体设备的第一基板或第二基板的表的方法]可另外包括使用DNA聚合酶延伸包含杂交至所释放的细胞或细胞器核酸(或标记发射的核酸序列)的条形码的DNA，以产生包含条DNA甲基化(使用Methyl_seq或亚硫酸氢盐测序)或染色质结构(使用转座酶可及染色质测第一链cDNA合成和第二链cDNA合成后在由细胞或细胞器释放的RNA上形成的双链DNA进行以将条形码连接至基因组DNA，例如在限制性消化后(用于基因组DNA测序或DNA甲基化分选地，包含条形码的核酸与第一链cDNA合成后在由细胞或细胞器释放的RNA上形成的RNA_形成的双链DNA重组(用于RNA测序)。在一个优选的实施方案中，寡核苷酸包含嵌合末端义的用于标记各个细胞或细胞器的试剂盒的成分标志物(包括抗体抗人CD98和凝集素PHA缀合的荧光和生物素化的寡核苷酸(ASO：抗体链霉亲和素寡核苷酸)的普遍存在的细胞表测量。根据表2制备反应混合物。在37℃下温育90分钟，并使用热循环仪(CFX384Touch,Biorad)以每分钟2个循环进行荧光测量。b.用于图2.1中所呈现的寡核苷酸的等温产生的胞上的所有荧光报告基团(SEQIDNO:9)都部分地杂交至携带淬灭剂(ID4)的序列。在T1[0309]在补充有10％热灭活的胎牛血清(Gibco10082147)和1％青霉素_链霉素(Gibco15140122)的RPMI1640培养基(Gibco61870044)中培养Jurkat人T淋巴细胞ATCC8TIB_[0311]首先使用链霉亲和素缀合试剂盒方案(ab102921)将纯化的抗体(Biolegend)和凝集素(EurobioScientific)与链霉亲和素缀合。然后将缀合的标志物在1xtris缓冲盐水温度控制在20℃与25℃之间的室内超过12小时(过夜)。生物素化的寡核苷酸购自IDT，在磷酸缓冲盐水(PBS，Gibco10010023)中洗涤三次，随后在具有400μg/ml的DSS(SigmaD8906)和5mMEDTA(Sigma03690)的细胞染色缓冲液(Biolegend420201)中洗涤三次。将组织用1μg至10μg的与荧光团或荧光寡核苷酸缀合的抗体或凝集素在500μl的细胞染色缓冲液(Biolegend420201)中于4℃下染色30分钟。然后将小块在10ml的1x磷酸盐缓冲盐水929)进行解离。解离后，将细胞在40μm下过滤，用10ml的tris缓冲盐水(TBS，VWR[0315]将200,000个细胞重悬于含有400μg/ml的DSS(SigmaD8906)和5mMEDTA(Sigma03690)的100μL细胞染色缓冲液(Biolegend420201)中。将细胞与5μL的Fc受体阻断溶液(Biolegend422301)一起在黑暗中于4℃下温育10分钟，随后添加0.2μg至2μg的与荧光团于4℃下温育30分钟，之后在前述细胞染色缓冲液混合物中冲洗两次，并在Tris缓冲盐水[0318]我们首先使用流式细胞术(GuavaeasyCyte12HT)证明了标志物非特异在对Jurkat和Ramos细胞系进行染色后不存在标志物交换。通用细胞标志物选自抗人CD98(BioLegend315603，315602)、抗人CD298(BioLegend341709)或抗人β2_微球蛋白与解离之前和之后染色的组织进行比较，并且我们通过流式细胞术(GuavaeasyCyte[0325]我们还测试了若干等温扩增，目的是使用类似数量级的试剂和将用于组织的核[0337]本发明人还测试了其他聚合酶(bst、bsu、phi29)、切口内切核酸酶(Nt.AlwI、略以及使用不同扩增策略的其他寡核苷酸设计(如图[0341]在含有10％热灭活的胎牛血清(Gibco10082147)和1％青霉素_链霉素(Gibco15140122)的DMEM(41965039)中培养HEPG2(ATCCHB_8065)。根据ATCC推荐，在37℃、5%[0342]在内皮细胞生长培养基(PromocelC_22010)和1％青霉素_链霉素(Gibco[0345]使用链霉亲和素缀合试剂盒(Abcam102921)将纯化的抗人CD146(Biolegend1xtris缓冲盐水(TBS，VWRCAYM600232_500)中与生物素化的寡核苷酸以1:12比率混合，并且避光保存在温度控制在20℃与25℃之间的室内超过12小时(过夜)。纯化的抗人CD146与由SEDIDNO:8组成的序列缀合，并且纯化的抗人CD146与由SEQIDNO:1组成的序列缀光素修饰被对光漂白不太敏感的修饰ATTO488荧光团替换，并且在生物素修饰与称为A的[0348]用1ml细胞染色缓冲液(Biolegend420201)洗涤48孔板的孔中的细胞。向细胞中加入20μl每种抗体缀合的寡核苷酸(0.1μg/μl抗体)、1μlAlexaFluor647(Al647)抗人CD146抗体(Biolegend361013)和2μlBrilliantViolet421(BV421)抗人CD326[0349]抗人CD146抗体对内皮细胞(包括HUVEC细胞)具有特异性，而抗人CD326抗体对上皮细胞(包括HEPG2细胞)具有特异性。这意味着HUV(MRD70170)和滤光轮(TI2_P_FWB_E)、四波段二向色和发射滤光片(Semrock，FF409/493/[0358]存在于HUVEC细胞表面处的荧光报告基团(SEQIDNO:9)部分杂交至携带淬灭剂[0359]在温育开始后40分钟，发明人观察到在ATTO488中出现信号，与Al647通道中的[0361]使用链霉亲和素缀合试剂盒(Abcam102921)将纯化的抗人β2_微球蛋白抗体(Biolegend316302)与链霉亲和素缀合。然后将缀合的抗体在1xTris缓冲盐水(TBS，VWRCAYM600232_500)中与生物素化的寡核苷酸以1:12比率混合，并且避光保存在温度控制在体与SEQIDNO:1在一个管中混合并与SEQIDNO:1SEQIDNO:1缀合的抗人β2_微球蛋白抗体和5μg/ml的与SEQIDNO:10缀合的抗人β2_微球蛋白抗体在细胞染色缓冲液中的混合物在4℃下温育15分钟至20分钟。然后用细胞染色缓钟并有规律地上下移液之后，用细胞滤网(100μm)过滤消化的样品并使用含有1％HS[0370]为了通过使用热致动性笼状物获得空间解析的scRNA_seq，使用来自本发明的实[0373]遵循以下文献的补充信息中描述的步骤合成烯官能化的立即将具有3体积％巯基丙基三甲氧基硅烷(ABCRGelest)的无水甲苯溶液在氮气下在反[0380]用二硫醇交联剂将预先形成的官能化pNIPAM(烯反应型)旋涂在经硫醇改性和微结构化的PDMS基板上。将含有浓度介于3重量％与15重量％之间的官能化pNIPAM和浓度介于3重量％与10重量％之间的二硫代赤藓醇(购自西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich)，CAS号3483_12_3)交联剂的几个100μL丁醇和甲醇溶液(V/V＝1/1)的微量体积沉积到基板[0383]所使用的第二基板是点缀着DNA链的玻璃载玻片(购自安捷伦公司，被称为置在DNA阵列的顶部，使得所关注的区域面向水凝胶结构。通过将芯片储存在70℃的烘箱[0394]5Phos/TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTT像使得能够鉴定荧光DNA探针先前已经在其上杂交的某些斑点。这些圆圈的相对位置限定[0398]在40℃下注射补充有1mMATP(NEB#P0756S)的Thermopol1x(NEB#B9004S)中含有[0400]用TBS中的1％BSA制备浓度为1千万个/ml的细胞悬浮液。将细胞以100μl/h注射[0403]停流10分钟后，通过打开笼状物(将温度升高至3[0405]通过在37℃下