CN119498443A 制造裂解细胞悬浮液的方法 （柯碧恩生物技术公司）

202080007471.92020.01.03固体含量为至少10wt.且粒径Dv90值为100至300微米。本发明的裂解细胞油悬浮液通常具有括给动物喂食该饲料产品的饲养动物的方法和通过给动物喂食该饲料产品可持续地生产肉类21.固体含量为至少10wt.％且粒径Dv90值为100至300微米的裂解细胞油悬浮液，所述细胞悬浮液包含裂解的细胞物质和油，所述细胞悬浮液的固体别是至少20wt.更特别是至少25wt.甚至更特别是至少30wt.％。3.根据权利要求1或2所述的裂解细胞悬浮液，4.根据权利要求1至3中任一项所述的裂解细胞悬浮液，其含量为至多10wt.特别是至多8wt.更特别是至多6wt.甚至更特别是至多4wt.%,还更特别是至多2wt.最特别是至多1.0wt.％。6.制造浸渍颗粒的方法，其中将多孔颗粒与根据权利要求1_4中任一项所述的裂解细空下用所述组合物涂布多孔颗粒，其中裂解细胞悬浮液的粒径Dv90值为150微米至250微7.饲料产品，其包含权利要求1_4中任一项所述的组合物或权利要求6所述的方法的产物，其中所述饲料产品任选地是水产养殖饲料或9.一种通过给动物喂食权利要求7所述的饲料产品来可持续生产肉类产品的方法，其3[0002]本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2019年1月3日提交的美国临时专62/787,974和2月15日提交的欧洲专利申请号19157377.3的优先权权益，二者的标题均为为“ProcessforManufacturingLysedCellSuspension(制造裂解细胞悬浮液的方4能够长期储存，固体在储存容器的底部的沉降最小并且没有(或最少的)硬堆积(hard[0011]本发明涉及一种制造固体含量为至少10wt.％且粒径Dv90值为100至300微米的裂[0013]b)使微生物细胞物质和油的混合物经受一个或多个剪切步骤以实现至少部分细[0015]d)使微生物细胞物质和包含裂解细胞的油悬浮液的混合物经受一个或多个剪切步骤以实现至少部分细胞的裂解并产生进一步的包[0021]本发明进一步涉及通过给动物喂食根据本发明的饲料产品可持续地生产肉类产5[0024]从根据本发明的方法获得的裂解细胞油悬浮液的粒径分布可以看出根据本发明粒径Dv90值。更具体地，将裂解细胞油悬浮液样品分散在合适的(shoutable)无颗粒的油[0025]具有更高细胞生物质负载的裂解细胞油悬浮液提供每体积单位更大量的有价值[0026]图1显示了六种不同的裂解细胞油悬浮液样品在25℃下的剪切速率(1/s)与粘度胞物质和50wt.％菜籽油的裂解细胞油悬浮液测试样品。其他裂解细胞悬浮液测试样品源[0028]图3显示了根据本发明的一个实施方案的系统，其显示了微生物细胞物质和油的[0029]图4显示了根据本发明的一个实施方案的系统，其显示了包含裂解细胞的油悬浮液通过高剪切混合器13(例如YTRONZ)以裂解油中的细胞的再循环。悬浮液的流动以虚线[0030]图5显示了根据本发明的一个实施方案的系统，其显示了微生物细胞物质通过低剪切混合器12的分散和通过同一回路中的高剪切混合器13裂解油中的细胞以产生悬浮液。[0031]图6显示了具有约20％生物质和约80％菜籽油的悬浮液在经过低剪切、中等剪切6[0034]通过卡尔费歇尔滴定(KarlFischertitrat带有DM143SC电极且极化电流设置为24.0μA的MettlerToledoV30KF滴定仪，该值是油)提取到溶剂层中，在本例中为己烷。通过加入水并施至少10wt.至少15wt.特别是至少20wt.更特别是至少25wt.甚至更特别是至特别地，微生物细胞物质的水含量小于8wt.更特别地小于6wt.甚至更特别地小于含量在0.5wt.％至8wt.％之间，更特别地在1wt.％至5wt.％之间，甚至更特别地在明的方法的细胞物质通常占整个微生物细胞的至少10wt.特别是至少20wt.更特别是在至少30wt.或至少40wt.或至少50wt.或至少60wt.％。在规定范围内的微生物细胞物质可通过对包含微生物细胞的发酵肉汤进行干燥步骤来获得。含水发酵肉汤中微生物细胞的干燥可例肉汤)来增加肉汤的细胞含量来完成。脱水或浓缩是指将生物质从发酵肉汤或其他液体培7[0041]转鼓式干燥器通过将发酵肉汤(或脱水发酵肉汤)膜施加到滚动的加热转鼓的表器、流化床干燥器或移动流化床干燥器(例如，喷雾干燥器，GEAProcess(Rhodotorulaglutinis)、弯曲隐球菌(Cryptococcuscurvatus)和斯达氏油脂酵母(Thraustochytriaceae)和隐甲藻科(Crypthecodini[0043]隐甲藻属(Crypthecodinium)、Ulkenia、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、Aurantiochytrium和裂殖壶菌属(Schizochytrium)。在一个实施方案中，使用裂壶藻(Schizochytriumlimacinum)或Aurantiochytriumlima生物。在某些实施方案中，按干生物质重量计算，微生物细胞包含至少30wt.％、至少实施方案中，一种或多种产生花生四烯酸(A8胞被遗传修饰以在微生物细胞中产生一种或多种组合和/或比例的所需生物材料。这些微[0051]术语“总脂肪酸”是指在给定样品中可通过碱酯交换方法衍生为脂肪酸甲酯基甘油和三酰基甘油)和来自极性脂质部分[0053]总脂质中脂肪酸的浓度在本文中表示为TFA的重量百分比(％TFA)，例如每100毫9在5wt.％至20wt.％之间或在10wt.％至15wt.步骤。在添加一部分微生物细胞物质之后进行的剪切步骤的数量可以在很宽的范围内变生物细胞物质和包含裂解细胞的油悬浮液的混合物经受一个或多个剪切步骤以实现至少部分细胞的裂解并产生进一步的包含裂解细胞[0062]根据本发明的方法在油和悬浮液都处于液相的温度下进行。虽然没有特定的上更特别地在15℃至45℃的范围内的温度于15℃或在10℃和30℃之间。物细胞物质和油的混合物经受剪切步骤以实现至少部分胞的至少70％已被裂解，特别是至少75特别是至少80更特别是至少85还更特别碎机通过泵送细胞和油(例如菜籽油或其他植物油)的混合物通过限制孔阀来裂解细胞来在球磨机中处理生物质可通过控制尤其是轴的尖端速度、产品通过磨机的进料速度和/或合器或系统使用固定金属外壳(定子)内部的旋转金属轴(转子)。转子的旋转产生吸力效[0072]在根据本发明的方法中剪切步骤中的剪切程度可例如通过向剪切步骤提供的细胞/油混合物中裂解细胞的含量与该剪切步骤中排出的细胞/油混合物中裂解细胞的含量的细胞的80％被裂解，特别是至少85更特别是至少90还更多特别是至少95甚至[0074]可以优选本发明方法中的至少一个剪切步骤在比前一剪切步骤更高的剪切下进[0076]b)使微生物细胞物质和油的混合物经受至少一个剪切步骤以实现至少部分细胞[0078]d)使微生物细胞物质和包含裂解细胞的油悬浮液的混合物经受至少一个另外的一个或多个剪切步骤的组合组，使得进入该一个或多个剪切步骤的组合组的细胞的至少通常是指其中向该步骤提供的细胞的超过60％被裂解的[0082]当裂解细胞悬浮液太粘而无法在步骤(b)期间被泵送通过时，可将裂解细胞悬浮液泵入到更高剪切的步骤(d)中以降低其粘度并进一步裂解额外的微生物细胞。在一个实置与步骤(b)中使用的装置相比具有更高的剪切力(例如转子定子系统)。在一些实施方案[0084]一旦裂解细胞悬浮液返回到低剪切步骤(b)，一个或多个另外部分的微生物细胞细胞)到裂解细胞悬浮液中之后，裂解细胞悬浮液返回到步骤(d)中的更高剪切混合器装[0088]在(a)到(d)的任何步骤期间，可添加一个或多个冷却步骤以冷却裂解细胞悬浮骤允许悬浮液保持其温度在80℃或低于80℃,在70℃或低于70℃,在60℃或低于60℃,或在50℃或低于50℃,特别是在40℃或低于40℃,更特别是在35℃或低于35℃,在一些实施方案中在30℃或低于30℃。[0089]终产品(即最终裂解细胞悬浮液)的固体含量为至少10wt.至少15wt.特别是至少20wt.更特别是至少25wt.甚至更特别地至少28wt.在一些实施方案中为至少30wt.在一些实施方案中在20wt.％至40wt.％之间，在一些实施方案中在25wt.%悬浮液源自70_95wt.％的微生物细胞物质和5wt.％至30wt.％的添加油，特别是源自75_[0093]在根据本发明的方法的一个实施方案中，以至少1000kg/小时的速率加入微生物细胞物质。这允许悬浮液的商业规模生产。可以优选以至少2000kg/小时、特别是至少Hr/kg悬浮液之间，特别是介于0.060至0.130kW*Hr/kg之间，更特别是介于0.070至(用于将生物质引入液体中并施加剪切)的能量消耗可以介于0.090至0.130kW*Hr/kg悬浮步骤以产生裂解细胞油悬浮液。此类方法的一个实例在实施例3中提供。在其他实施方案[0098]本发明还涉及新的裂解细胞油悬浮液。根据本发明的新细胞油悬浮液具有至少10wt.％的固体含量和100至300微米的Dv90。优选裂解细胞油悬浮液的固体含量为至少15wt.特别是至少20wt.更特别是至少25wt.甚至更特别是至少28wt.在一些实施方案中为至少30wt.在一些实施方案中介于20wt.％至40wt.％之间，在一10wt.特别是至多8wt.更特别是至多6wt.甚至更特别是至多4wt.还更特别是解细胞油悬浮液的粒径Dv50值可以特别是在30_120微米的范围内。粒径Dv50值在MalvernMastersizer3000中如对Dv90所述那添加到悬浮液的载体油自身的密度高至少7％_20特别是高至少8％_16或高至少优势：每体积单位提供大量的有价值的生物材料例如DHA，以及最终悬浮液的运输成本较粘度比具有较低细胞生物质负载(50wt.％微生物细胞物质和50wt.％添加油)的悬浮液的粘度高至少40高至少50高至少100高至少150高至少200％。参见图1。粘度用与新鲜制备的悬浮液的粘度偏差小于10优选小于5更优选小于3％。另外地或可选地，60天后的粘度与新鲜制备的悬浮液的粘度偏差可小于10优选小于5更优选小于3％。143天后的粘度与新鲜制备的悬浮液的粘度偏差可小于10优选小于5更优选小细胞悬浮液的DHA含量为至少10wt.特别是至少15wt.更特别是至少18wt.还更特况下。例如，DHA含量可以是至少30wt.特别是至少35wt.更特别是至少40wt.在一于或小于多孔颗粒的平均孔径。裂解细胞油悬浮液的粒径Dv90值在100微米至300微米之[0110]可以将任何合适量的裂解细胞油悬浮液引入到饲料产品液或其组合物的情况下生产的肉相比，该方法可以进一步提供增加水平的ω_3脂肪酸(例[0117]通过标准异养发酵制备富含DHA(二十二碳六烯酸)的裂殖壶菌细胞并使用转鼓式的水含量，通常少于2％或少于1％的水。干燥的富含DHA的裂殖壶菌生物质也可以AlgaPrimeTMDHA(CorbionBiotech,Inc.,SouthSanFrancisco,USA)[0119]通过使用直接酯交换将样品转化为FAME来分析样品的脂肪酸组成。将样品(10_20mg)直接称重到16X100mm的具有PTFE内衬螺旋盖的试管中，然后添加200uL20mg/mL管盖上并置于保持在75℃的干浴中3.5小时，然后在酯交换过程期间间歇地在加热至75℃的超声仪浴中涡旋和超声处理两次。从干燥块中取出样品管，一旦冷却至室温后，将2mL的可接受的ERRF标准指南，使用相对于C19:0内标确定的每种FAME的经验相对响应因子裂解细胞悬浮液的固体含量为约32wt.％。裂解细胞油悬浮液的水含量小于5wt.通常小[0123]通过使用两种不同的设备——YTRON_ZC粉末分散系统(即低剪切混合器)和国)将实施例1的干燥的微生物细胞与植物油(例如菜籽油)混合来生产裂解细胞油悬浮液。形式)引入或分散到油中。将微生物细胞分散到油中之后，将混合物泵入到高剪切混合器或裂解效果。泵用于调用循环流，从而使得可以独立于循环回路中的其他设备(例如，[0124]在裂解细胞悬浮液生