CN119497822A 基于碳纳米材料的免疫分析法及其检测靶抗原的方法 （李知勋）

2024.12.30PCT/US2023/0265522023.06.29WO2024/006423EN2024.01.04基于碳纳米材料的免疫分析法及其检测靶本发明公开了一种用于检测样品中的靶抗2其中，当所述靶抗原与所述抗体的结合位点相结合时，氧化物酶(HRP)标记的抗体的化学发光、使用碱性磷酸酶(ALP)标记的抗体的化学发光检测、苯乙二醛衍生物化学发光检测和用与发光染料偶联的抗体操作的ODI化学发光检测的9.根据权利要求1所述的装置，其中所述标记物选自钌络合物(R12.根据权利要求1所述的装置，其中所述标记物选自辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷316.根据权利要求14所述的方法，其中所述碳纳米材料具有一种由氧化石墨烯构成的检测由与所述靶抗原结合的所述标记物标记的抗体所产生的19.根据权利要求17所述的方法，其中所述碳纳米材料具有一种由氧化石墨烯构成的22.根据权利要求17所述的方法，其中由与所述靶抗原结合的所述标记物标记的抗体23.根据权利要求17所述的方法，其中所述方法不使用与所述标记物偶联的人工制造26.根据权利要求17所述的方法，其中所述方法不包括在将所述样品溶液引入所述装27.根据权利要求17所述的方法，其中在将含有所述靶抗原的所述样品溶液引入所述32.根据权利要求28所述的方法，其中由与所述靶抗原结合的所述标记物标记的抗体433.根据权利要求28所述的方法，其中所述方法不使用与所述标记物偶联的人工制造36.根据权利要求28所述的方法，其中所述方法不包括在将所述样品溶液引入所述装38.根据权利要求28所述的方法，其中在将所述样品溶液引入所述装置之后30分钟内5[0002]本申请要求享有美国临时申请第63/357,892号的优先权和利益，该临时申请于[0003]本公开涉及生物和/或化学样本中目标物的检测与定量分析的免疫分析技术领域，尤其涉及一种使用表面固定有标记抗体的碳纳米材料来检测靶抗原的新型装置和方[0007]本文提供的背景技术描述是为了一般地呈现本公开的上下文。除非本文另有说以及一种基于使用碳纳米材料和与能够捕获和检测样品中的特异性抗原的标记物偶联的6记物抗原)结合的所述标记物标记的抗体(标记物且所述抗体与所述碳纳米材料之间的距离为1[0016]所述标记物可以选自吖啶酯化学发光检测、使用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗光检测以及用与发光染料偶联的抗体操作的ODI化学发光检测的化学发光[0017]所述标记物可以是选自以下检测的比色检测标记物：与HRP偶联的抗原结合抗体结合抗体进行的比色检测以及与葡萄糖氧化酶偶联的抗原结合抗体进行的比[0018]所述标记物可以是选自以下电化学发光检测标记物：用钌络合物(Ru(bpy)32+)标2O2)和电极。和(2)荧7[0029]所述抗体可以通过非共价π_π堆积相互作用固定在所述碳纳米材料的表且所述抗体与所述碳纳米材料之间的距离为1[0031]由与所述靶抗原结合的所述标记物标记的抗体所产生的所述信号选自生物发光、[0036]可以在将含有所述靶抗原的所述样品溶液引入所述装置后30分钟内发射所述信[0039]所述抗体可以通过非共价π_π堆积相互作用固定在所述碳纳米材料的表且所述抗体与所述碳纳米材料之间的距离为1[0045]所述方法可以不包括在将所述样品溶液引入所述装置之后去除废物的洗涤程8[0049]图2示出了根据本公开另一实施例的具有化学发光检测的所述一体化免疫分析示[0054]图7示出了根据本公开的另一个实施例，在所述一体化免疫分析中使用荧光素酶[0056]图9示出了根据本公开另一实施例的可用于所述所述一体化免疫分析的吖啶NHS[0057]图10示出了根据本公开另一实施例的在所述一体化免疫分析中使用(a)吖啶C2、NHS酯或(b)LumiwoTM吖啶NHS酯标记的抗体的吖啶酯化学发光反应机制。[0058]图11示出了根据本公开另一实施例的使用与(a)荧光素、(b)罗丹明B和(c)BDP连[0059]图12示出了根据本公开另一实施例的使用与HRP偶联的抗体的鲁米诺化学发光检[0060]图13示出了根据本公开另一实施例的使用与ABEI偶联的抗体的鲁米诺化学发光[0061]图14示出了根据本公开另一实施例的在AmplexRed存在下使用与HRP偶联的抗体是金刚烷基1，2二氧杂环丁烷磷酸酯衍生物之一)和ALP的反应操作的具有化学发光检测[0063]图16示出了根据本公开另一实施例的在FDP存在下使用ALP酶反应的具有ODI化学9[0066]图19示出了根据本公开另一实施例的使用苯乙二醛衍生物化学发光检测的所述[0067]图20示出了根据本公开另一实施例的使用苯乙二醛衍生物化学发光检测的所述[0068]图21示出了根据本公开另一个实施例的用通过(1)接头和(2)单链DNA与罗丹明[0069]图22示出了根据本公开另一实施例的具有ODI化学发光检测的所述多重一体化免[0070]图23示出了根据本公开的另一个实施例，使用能够捕获靶抗原的HRP标记抗体和[0071]图24示出了根据本公开的另一个实施例，使用能够捕获靶抗原的HRP标记的抗体[0072]图25示出了根据本公开另一个实施例的使用能够捕获靶抗原的HRP标记的抗体和作为底物的OPD(邻苯二胺二盐酸盐)进行比色检测的所述一[0073]图26示出了根据本公开另一个实施例的使用能够捕获靶抗原的HRP标记的抗体和作为底物的AmplexRed进行比色检测的所述一[0074]图27示出了根据本公开另一个实施例的使用能够捕获靶抗原的ALP标记的抗体和pNPP(对硝基苯基磷酸二钠盐)底物的具有比色检测的[0075]图28示出了根据本公开另一个实施例的使用能够捕获靶抗原的β一半乳糖苷酶标记的抗体和作为底物的TMB进行比色检测的所述一[0077]图30示出了根据本公开的另一个实施例，使用能够捕获靶抗原的ALP标记的抗体[0078]图31示出了根据本公开另一个实施例的使用能够捕获靶抗原的HRP标记的抗体、N乙酰基4醌亚胺。[0079]图32示出了根据本公开另一个实施例的利用电化学发光检测的所述一体化免疫[0080]图33示出了根据本公开另一个实施例的利用电化学发光检测的所述一体化免疫[0081]图34示出了根据本公开另一个实施例的利用电化学发光检测的所述一体化免疫[0082]图35示出了根据本公开另一个实施例的利用酶标记的抗体和底物操作的荧光检[0083]图36示出了根据本公开另一个实施例的利用荧光染料标记的抗体操作的荧光检[0084]图37示出了根据本公开另一个实施例的能够用肉眼感测阳性和阴性样品的所述[0085]图38示出了根据本公开另一个实施例的使用能够感测放射性的辐射计的所述一[0086]图39示出了根据本公开另一个实施例的(a)用透射电子显微镜(TEM)观察到的纯[0087]图40示出了根据本公开另一个实施例的暂时固定在磁性碳纳米材料上的抗体偶[0088]图41示出了根据本公开的另一个实施例，用6种不同磁性碳纳米材料操作的所述[0089]图42示出了根据本公开另一个实施例的(a)固定在聚苯乙烯孔的表面上的氧化石[0090]图43示出了根据本公开另一个实施例的在聚苯乙烯的表面上形成氧化石墨烯膜。[0092]图45示出了根据本公开另一个实施例的在磷酸钠缓冲液中用在各种pH下形成的氧化石墨烯膜操作的用于定量人血清中的D_二聚体的所述一体化免疫分析中的CL/[0093]图46示出了根据本公开另一个实施例的用在各种缓冲液中的与吖啶酯偶联的抗体分子操作的用于定量人血清中的D_二聚体的所述一体化免疫分析[0095]图48示出了根据本公开另一个实施例的(a)用作所述一体化免疫分析的检测方法的吖啶和鲁米诺化学发光之间的相关性，(b)用作所述一体化免疫分析的检测方法的吖啶共卫生和食品安全相关的各种样本)中以非共价π_π堆积相互作用微弱但稳定地与碳纳米团可以与碳纳米材料非共价相互作用。(参见S.Shahriari,M.Sastry,S.Panjikar和通过π_π堆积相互作用固定在碳纳米材料的表面上时，所述抗体和所述碳纳米材料之间的析的与生物或化学材料偶联的人工制造的抗原和(2)用于夹心免疫分析的与生物或化学材所述快速一体化免疫分析发射的1，1'一草酰二咪唑(ODI)化学发光随着样品中甲状腺素校准曲线的所述一体化免疫分析的灵敏度优于耗时的夹心免[0102]所述一体化免疫分析可以运用应用于常规竞争性和夹心免疫分析的所有检测方二亚胺方法和高碘酸盐方法)中的一种，将用于所述一体化免疫分析的特异性抗体与一种204.[0106]*H.Jiang,G.D.D'Agostino,P.A.Cole.和D.R.Dempsey，《酶学方法》，2+和三磷酸腺苷(ATP)的TrisHCl(50mM，pH8.5)溶液的情况下发射明亮的生物光。所述一体化免疫分析通过调节在所述一体化免疫分析中用于产生生物发光的试剂浓疫分析在加入三种试剂后，立即对所述一体化免疫分析中的生物发光进行时长为5秒的测(1)HNO3(25100mM)中的H2O2(540mM)和(2)含有痕量浓度的TritonX100的NaOH(0.1作的所述一体化免疫分析中的吖啶酯化学发光随着人血清中D一二聚体的增加而成比例地增强。基于从化学反应形成的高能中间体到发光染料的化学发光共振能量转移(CRET)原免疫分析可以使用与2一4种发光染料结合的抗体同时对样品中存在的多种靶抗原进行分话说，使用吖啶酯连接的发光染料的所述一体化免疫分析可以作为一种新的多重测定方析中发射的化学发光的亮度随着样品中靶抗原浓度图15中所示的机制操作的具有化学发光检测的所述一体化免疫分析来定量人血清中痕量可靠的方法对检测单元中发出的化学发光强度进行5[0121]荧光素二磷酸酯(FDP)和4一甲基伞形酮磷酸酯(4一methylunbelliferyl17中所示的机制，可以应用具有ODI化学发光检测的所述一体化免疫分析来定量样品中的光染料和苯乙二醛衍生物相偶联，并带有化学发光检测功能的所述一体化免疫分析方法。一体化免疫分析方法来定量测定人血清中的D一二聚体的痕量水平，其反应机制如图19所能力的抗体与不同的发光染料偶联以发射出独特颜色的化异丙醇中的H2O2和乙酸乙酯中的ODI的情况下发射红色化学发光。通过单链DNA连接的所述明101偶联的D二聚体抗体的所述一体化免疫分析比通过接头的所述一体化免疫分析更灵体化免疫分析可以用作能够同时定量存在于图22所示的样品中的不同靶抗原的多重一体[0128]如图2326所示，几种不同类型的底物可用于具有比色检测的所述一体化免疫分检测的所述一体化免疫分析的灵敏度取决于在HRP和H2O2存在下为酶反应添加的底物的性[0130]使用pNPP(对硝基苯磷酸二钠)作为ALP标记抗体的底物，可以应用具有比色检测一体化免疫分析的检测限(3.5ng/ml)略高于使用TMB的HRP标记抗体的所述一体化免疫分[0131]3.3用与其他酶而不是常规酶如ALP和HRP偶联的抗原结合抗体操作的具有比色检[0132]具有比色检测的所述一体化免疫分析可以用与其他酶而不是HRP和ALP偶联的抗育一定时间(1030分钟)后，将含有抗原结合的抗体偶联的ALP(或HRP)的溶液从孔中转移[0137]图32顶部所示的钌络合物标记的抗体结合的靶抗原(Ru(bpy)32+<抗体>抗原)通过发态存在的高能中间体(Ru(bpy)32+*)。最后，通过从激发态的Ru(bpy)32+*到基态的Ru的靶抗原可以用于产生从Ru(bpy)32+发射的电化学发光，因为纳米颗粒可以在电化学发光由图2中所示的所述一体化免疫分析的第一程序形成。将含有Au<抗体>抗原的小体积溶液应产生Ru(bpy)32+*的共试剂。Au的作用与丙胺在钌络合物电化学发光反应中的作用相同。[0140]图34示出了由图2中所示的所述一体化免疫分析的第一程序形成的ABEI标记的抗[0143]所述一体化免疫分析可以用能够感测由荧光染料发射的可见光的荧光检测来操形成的酶标记的抗体结合抗原(酶<抗体>抗原)与底物反应一定的温育时间以产生荧光染的所述一体化免疫分析的检测限低至0.5ng/mL，其比人类血清中的正常D一二聚体浓[0145]具有荧光检测的所述一体化免疫分析也可以应用于荧光染料标记的抗体结合抗的抗体的所述一体化免疫分析的检测限(8.2ng/ml)比使用HRP标记的抗体的所述一体化免所述一体化免疫分析可以用作能够同时感测样品中不同类型的靶抗原的多[0147]可以应用所述一体化免疫分析法以用肉眼观察阳性或阴性结果。例如，Zonyl胺由ALP标记的抗体结合抗原的反应形成，所述抗体结合抗原由所述一体化免疫分析的第可以基于图37所示的机制开发能够用肉眼感测阳性和阴性样品的所述一体化测量的放射性随着靶抗原浓度的增加而成比到检测孔中以去除在温育之后由固定在测试试剂盒表面上的同位素标记的抗原产生的相[0153]为了操作图2中所示的所述一体化免疫分析，重要的是基于抗体和碳材料之间的去除残留在溶液中的抗体是降低在不存在靶抗原的情况下测量的背景以及增强所述一体在ππ堆积相互作用将抗体附着至磁性氧化石墨烯之后剩余的含[0160]将用储备溶液稀释的抗体偶联的吖啶酯(1μg/mL)与磁性碳纳米材料(20μg/mL)在[0162]将固定在磁性碳纳米材料(20上的抗体偶联的吖啶酯的1.5mL离心管中。将混合物在转子中旋转(18rpm)的同时温育烯操作的所述一体化免疫分析比用其他磁性碳纳米材料操作的所述一体化免疫分析更灵的所述一体化免疫分析可以在统计学上可接受的误差范围(<5％)内定量人血清中低至10_20nm多壁碳纳米管、20_30nm多壁碳纳米管和30_50nm多壁碳纳米管来制备固定在平坦[0170]将含有6种不同类型的碳纳米材料中的一种的聚苯乙烯孔在室温或65℃下在烘箱和石墨烯膜的所述一体化免疫分析的精度不如使用均匀氧化石墨烯膜的所述一体化免疫干燥多壁碳纳米管看起来像是均匀的膜或已经分裂，多壁碳纳米管在添加PBS的情况下立一定温度(20_70℃)下蒸发的过程。图43(a)示出了在PBS(pH7.4)中形成均匀的氧化石墨组分是磷酸根离子。存在于PBS和TBS中的NaCl和KCl不是产生均匀氧化石墨烯膜的主要因[0176]将PBS中的70μL与吖啶酯(1μg/mL)偶联的抗体添加到图43中所示的氧化石墨烯膜含有D_二聚体(2.5ng/mL)的另一标准品以测量在所述一体化免疫分析中发射的化学发光在使用第二注射泵添加含有TritonX_100(125μl)的0.25MNaOH后，立即测量从钠缓冲液(pH7)中形成的氧化石墨烯膜操作的所述一体化免疫分析比用在Tris_HCl缓冲氧化石墨烯膜的所述一体化免疫分析的灵敏度不如使用均匀氧化石墨烯膜的那些。此外，用在Tris_HCl缓冲液中形成的均匀氧化石墨烯膜操作的所述一体化免疫分析的灵敏度取液(pH7.5)中形成的氧化石墨烯膜的所述一体化免疫分析比使用在其他磷酸钠缓冲液中液(pH6)中形成的不规则分裂的氧化石墨烯膜的所述一体化免疫分析的灵敏度不如具有均匀氧化石墨烯膜的所述一体化免疫分析的灵敏[0180]所述一体化免疫分析的灵敏度取决于含有能够与均匀的氧化石墨烯膜弱结合抗体的缓冲液。使用含有与吖啶酯偶联的D_二聚体抗体的PBS(pH7.4)的所述一体化免疫分析比使用含有相同抗体的其他缓冲溶液的其余所述一体化免疫分析更灵敏，如图46所示。的CL/CL0高于那些使用含有相同抗体的Tris_HCl和磷酸钠缓冲液的所述一体化免疫分析。均匀氧化石墨烯膜的各种缓冲液的所有所述一体化免疫分析可以用于定量人血清中D_二00[0182]将PBS(pH7.4)中的70μL与荧光素酶(0.25μg/mL)偶联的D_二聚体抗体添加到固氧化石墨烯膜的表面上的荧光素酶偶联的D_二聚体抗体被用于使用具有基于图7中所示的定在氧化石墨烯膜的表面上的与HRP偶联的D一二聚体抗体来操作具有ODI化学发光检测的弱固定在氧化石墨烯膜的表面上的与ALP偶联的D一二聚体抗体进行具有ODI化学发光检测用于使用基于图19中所示的程序的具有苯乙二醛衍生物检测的所述一体化免疫分析来定[0188]所述一体化免疫分析的灵敏度取决于与D一二聚体抗体偶联的材料的性质以及检清标准品共八个。这些标准品用于通过不同的化学发光检测方法(例如吖啶、鲁米诺和[0191]将80μL标准品(或未知样品)置于制备用于具有吖啶化学发光检测的所述一体化[0192]将80μL标准品(或未知样品)置于制备用于利用鲁米诺化学发光检测的所述一体[0193]将80μL标准品(或未知样品)置于制备用于具有AMPPD化学发光检测的所述一体化果与那些使用另外2种其他化学发光检测的一致。图48中所示的良好相关性表明所述一体化免疫分析可以使用任何化学发光检测来快速定量具有吖啶化学发光的所述一体化免疫分析的选择性与其他具有化学发光检测(例如鲁米[0198]所述一体化免疫分析的组分通过(1)与诸如生物发光发射体(例如，荧光素衍生