17-羟孕酮（17 OHP）酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书

17-羟孕酮（17-OHP）酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书本产品为竞争抑制型酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，用于体外定量测定人血清、血浆及新生儿足跟滤纸干血斑中17α-羟孕酮（17-OHP）含量。使用前请完整阅读本说明书；操作应严格按本文规定的加样量、温育时间与洗涤次数执行，任何偏离都可能影响结果的可信度。文件性质说明：本说明书依据YY/T1958—2025《17α-羟孕酮测定试剂盒（标记免疫分析法）》的技术要求与现行竞争法ELISA产品的通行结构编写，供说明书编制、审核与实验室使用。产品名称、注册证编号、批号、有效期及各项性能实测值，须以实际产品的注册资料与批检验报告为准。1.产品名称与预期用途项目内容说明中文名称17-羟孕酮（17-OHP）酶联免疫吸附测定试剂盒又称17α-羟孕酮测定试剂盒（酶标记免疫分析法）英文名称17-Hydroxyprogesterone(17-OHP)ELISAKit缩写17-OHP、17OHP、17α-OHP包装规格96人份／盒（12条×8孔）；48人份／盒可选不足96人份时可拆条使用，余条按规定密封保存方法学竞争抑制型微孔板酶联免疫分析法，HRP／TMB显色体系均相竞争，无需提取，直接加样样本类型人血清、血浆（EDTA或肝素抗凝）、新生儿足跟滤纸干血斑三类样本的校准曲线与报告单位不同，不得混算检测范围血清／血浆0.2～20.0ng/mL；干血斑1.5～70.0ng/mL超出上限的样本稀释后复测，结果乘以稀释倍数储存条件2～8℃避光保存，不可冷冻整盒试剂运输过程避免高温、暴晒与剧烈震荡有效期12个月（自生产之日起，以标签标示为准）开封后组分按“储存条件与有效期”一节执行注册／备案号〔按产品注册证填写〕体外诊断用途，管理类别以注册证为准1.1预期用途用于体外定量测定人血清、血浆及新生儿足跟滤纸干血斑中的17α-羟孕酮含量，临床上用于先天性肾上腺皮质增生症（CAH，最常见为21-羟化酶缺陷）的辅助诊断、新生儿筛查及治疗随访中的激素水平监测。本产品仅供体外诊断使用，不用于血液筛查、供血者筛查或法医学鉴定；检测结果不作为CAH诊断的唯一依据，须结合临床表现、电解质与血气分析、影像学及基因检测（如CYP21A2变异）综合判断。2.检测原理17-OHP为分子量约330Da的小分子类固醇激素，难以采用双抗体夹心模式，故本试剂盒采用竞争抑制法。微孔板预先包被抗17-OHP的单克隆抗体，样本（或校准品）与恒定量的辣根过氧化物酶（HRP）标记17-OHP同时加入孔内，二者竞争结合固相抗体上的有限位点。温育后洗去未结合物，加入四甲基联苯胺（TMB）底物。结合的HRP催化TMB由无色变为蓝色，在终止液作用下转为黄色，于450nm（参比630nm）测定吸光度。样本中17-OHP浓度越高，酶标记抗原占据的位点越少，显色越浅——即吸光度与待测物浓度呈负相关。以校准品浓度对数值与对应吸光度作四参数逻辑（4PL）拟合，即可由样本吸光度回算浓度。血清中的17-OHP大部分与皮质类固醇结合球蛋白（CBG）结合，样本稀释液的作用是使激素从结合蛋白上解离，保证竞争反应测到的是总17-OHP，因此加样顺序与稀释液用量不得省略或更改。3.试剂盒组分组分规格（96人份）主要成分与状态开封后储存包被微孔板12条×8孔可拆卸聚苯乙烯条，包被抗17-OHP单克隆抗体，含干燥剂2～8℃密封干燥，4周内用完校准品A～F6瓶，0.5mL／瓶冻干品，人血清基质，浓度依次为0、0.5、1.5、5.0、15.0、30.0ng/mL（以标签为准）复溶后2h内使用；分装−20℃可存4周，仅冻融一次酶结合物1瓶，6mLHRP标记17-OHP，即用型，含蛋白稳定剂与防腐剂2～8℃避光，勿冻融样本稀释液1瓶，12mL含蛋白缓冲液与激素解离剂，用于样本稀释与干血斑洗脱2～8℃，开封后1个月内用完浓缩洗涤液1瓶，30mL，20×含Tween-20的磷酸盐缓冲液稀释后2～8℃存放不超过1周底物液TMB1瓶，12mL四甲基联苯胺／过氧化氢，无色或微蓝色液体2～8℃避光，禁止接触金属离子终止液1瓶，12mL0.5mol/L硫酸室温密封，有效期同整盒封板膜3片一次性使用室温干燥使用说明书1份含本说明书与检验合格证—混用限制：不同批号的包被板、校准品与酶结合物不得交叉混用；校准品已按批次配套赋值，更换批号须重建校准曲线。组分出现浑浊、沉淀、渗漏或超过有效期时不得使用。4.储存条件与有效期未开封试剂盒于2～8℃避光保存，有效期12个月，禁止冷冻。试剂盒应存放在远离热源、避免阳光直射且儿童不可触及的位置；运输过程应防潮、防重压、防雨雪浸淋，避免与酸碱物质同车运输。开封后：包被板取出所需条数后应立即将余条连同干燥剂放回自封袋，密封后2～8℃保存，4周内用完；不得在室温敞口放置超过30min。复溶后：校准品复溶后在2h内使用，剩余量按单次用量分装并于−20℃保存4周，避免反复冻融。稀释后：1×洗涤液在2～8℃存放不超过1周，出现浑浊即弃用。底物异常：TMB若在未加酶结合物前已呈明显蓝色，说明已被氧化失效，整瓶不得使用。5.样本采集、处理与保存样本质量直接决定结果的可信度。所有样本均应按潜在传染性物质处理，采集与操作过程须符合实验室生物安全规程，禁止使用叠氮钠作为防腐剂（其对HRP有抑制作用）。5.1血清与血浆样本采集空腹静脉血3～5mL，置促凝管（血清）或EDTA／肝素抗凝管（血浆），室温静置30min后3000rpm离心10min，小心吸取血清或血浆，避免吸入红细胞与纤维蛋白。溶血、脂血、黄疸样本应在报告中标明；血红蛋白高于5g/L的样本不建议使用。样本在2～8℃可存放48h，−20℃可保存6个月，检测前于室温缓慢解冻并充分混匀，仅冻融一次。5.2新生儿滤纸干血斑样本按新生儿疾病筛查采血规范，在出生72h后、充分哺乳6次以上，自足跟内侧穿刺采血，将血滴自然渗满滤纸片（如903采血卡）正反面，避免重复滴加与挤压；平置自然晾干3～4h，不得烘烤、日晒或叠压。血斑应无血清环、无污染、直径不小于8mm。检测时用3mm打孔器取血片一枚，置于孔内，加样本稀释液200μL，室温振荡洗脱2h（或4℃过夜），洗脱液直接参与竞争反应。血斑卡在2～8℃干燥避光条件下可存3个月，长期保存应−20℃密封并加干燥剂。采血过早（出生24h内）、早产、低体重、输血后及应激状态，均可导致17-OHP假性升高，需在规定时间重新采血复查。样本类型采集与处理要点检测用量保存条件血清促凝管，3000rpm离心10min，取上清50μL2～8℃48h；−20℃6个月血浆EDTA或肝素抗凝，离心后取血浆，抗凝剂类型须固定50μL同上，避免反复冻融干血斑足跟采血，自然晾干，3mm打孔1枚血片+200μL稀释液2～8℃干燥避光3个月；−20℃更长6.需自备的器材与试剂酶标仪，可测450nm与630nm，读板精度不低于0.001A洗板机或八道洗瓶、吸水纸；单道与多道移液器（10～100μL、100～1000μL）及配套吸头37℃恒温箱或水浴箱、计时器、振荡器台式离心机、−20℃冰箱、分析纯蒸馏水或去离子水新生儿血斑检测另需3mm打孔器与采血卡一次性手套、护目镜、吸水垫与废弃物收集容器7.试剂准备平衡：自冰箱取出试剂盒，室温放置30min。校准品与酶结合物不宜长时间暴露于室温，用后立即归位。洗涤液：将20×浓缩洗涤液用蒸馏水按1∶19稀释（30mL浓缩液加570mL水），充分混匀至无结晶，现配现用。稀释倍数不足会造成洗涤不彻底、背景升高。校准品复溶：按标签标示体积加入蒸馏水，室温静置15min，轻柔颠倒混匀，避免起泡；复溶后浓度依次对应标签标示值。样本处理：血清、血浆样本直接加样；干血斑按上节洗脱。样本中17-OHP浓度预计高于20ng/mL时，先用样本稀释液作1∶5或1∶10预稀释，结果乘以稀释倍数。板条准备：按检测量取出条数，余条立即密封归位；将板条固定于板架上，记录孔位布局。8.检验方法布孔：设空白孔1个（不加样本、不加酶结合物，仅加显色底物，用于调零与背景监控）；校准品A～F各设双孔；质控品按低、中、高各设1孔；其余为样本孔，建议每份样本单孔，疑难样本双孔复测。第一次加样：校准品、质控品与样本各50μL加入对应孔底部，避免沾壁与产生气泡；干血斑洗脱液同样加50μL。每更换一种液体即更换吸头。加酶结合物：除空白孔外，每孔加入酶结合物50μL。加样顺序与第一次加样一致，尽量在5min内完成整板加样，减少前后孔温育时间差。第一次温育：轻振混匀10s，覆封板膜，置37℃温育60min。温育时板底应接触均匀热源，避免叠放与局部温差。洗板：揭膜，弃去孔内液体，每孔注满1×洗涤液约350μL，静置30s后甩干拍干，重复5次。洗板机应设浸泡程序；最后一次拍干后立即进入下一步，不得让孔干燥。显色：每孔加TMB底物100μL（含空白孔），37℃避光显色15min。显色时间以校准品A孔呈深蓝色、F孔呈浅蓝色为宜。终止与读数：每孔加终止液50μL，加样顺序与底物一致，轻轻混匀，颜色由蓝转黄；10min内在450nm读数，630nm作参比。终止后若出现气泡，用针尖挑破后再读。关键控制点：整板加样时间差、洗板残留、温育温度与时间是竞争法误差的三大来源。手工洗板时，每孔液体必须注满且完全弃净；使用自动洗板机应定期校验注液量与残留量。9.结果计算校正吸光度：每孔A=A450−A630（无630nm通道时可直接用450nm单波长）。空白孔A值应低于产品规定上限，否则提示洗涤不彻底或底物污染。拟合曲线：以校准品浓度的对数为横坐标、校正吸光度为纵坐标，采用四参数逻辑（4PL）拟合：A=(Amax−Amin)／〔1+(C／C50)B〕+Amin。曲线相关系数r应不低于0.990，各校准点回算浓度与标示值的偏差应在±20%以内（最低点可放宽至±25%）。样本浓度：将样本校正吸光度代入曲线方程求浓度。样本吸光度低于最高校准品（浓度30ng/mL）对应值时，说明浓度已超上限，须稀释后复测，最终结果乘以稀释倍数。单位换算：干血斑结果按洗脱体积折算为全血当量浓度；如需以nmol/L报告，按1ng/mL≈3.03nmol/L换算（17-OHP分子量330.46）。报告：报告应注明样本类型、稀释倍数、检测方法与检测日期。不同方法学、不同样本类型（血清与干血斑）的结果不可直接比较。参考区间：17-OHP水平随年龄、性别、青春期发育、月经周期与妊娠状态变化显著，新生儿出生后数周内存在生理性升高，任何固定参考区间都不具普适性。各实验室应依据本地人群建立并验证参考区间；新生儿筛查的阳性切值应按当地筛查方案与季节、胎龄分层设定，不得直接套用本说明书之外来源的数值。10.性能指标项目指标说明检出限血清／血浆≤0.1ng/mL；干血斑≤1.0ng/mL按YY/T1958—2025对空白限与检出限的要求设定线性范围血清／血浆0.2～20.0ng/mL；干血斑1.5～70.0ng/mL，r≥0.990至少5个稀释度，每点重复3次，最小二乘法拟合重复性CV≤8.0%（血清／血浆）；≤15.0%（干血斑）同批号、同板，低中高三个浓度各测10次批间精密度CV≤15.0%（血清／血浆）；≤20.0%（干血斑）3个批号各测10次，合并30次结果计算准确度相对偏差±15.0%以内，或回收率85.0%～115.0%用有证参考物质或加标回收试验评价特异性与孕酮、17α-羟孕烯醇酮、11-脱氧皮质醇的交叉反应率≤2.0%交叉物浓度100ng/mL，按50%置换水平计算溯源性校准品赋值可溯源至参考物质或参考测量程序溯源链、赋值过程与不确定度见产品技术报告上表为按现行行业标准设定的验收口径，用于判定产品是否满足要求；本批次产品的实测值以随盒批检验报告或注册技术要求为准。用于临床决策时，应以本实验室在用的实际批号数据为准，不应引用其他批号或文献中的性能数值。11.质量控制每次检测均应设质控，质控结果不合格时该批样本结果不得发出，须查明原因后整批重测。每板必设：空白孔1个、校准品6个浓度各双孔；复孔之间A值偏差应小于10%。质控品：至少使用低、中、高三个水平，基质应与待测样本一致（血清或血斑质控品），与样本同批处理。合格判定：曲线r≥0.990；校准点回算偏差在±20%内；质控值落在靶值±2SD内；空白孔A值低于产品规定上限。失控处理：依次核查试剂效期与开封时间、洗涤液稀释倍数、温育温度与时长、移液器校准与加样顺序；排除后重测。连续失控应更换新批号试剂或联系制造商。外部评价：建议参加省级以上临床检验中心的室间质评或新生儿筛查专项质控比对，至少每季度评估一次本实验室的检测中位数与分布。12.注意事项与生物安全本产品仅限体外诊断使用，须由经过培训的人员在具备相应条件的实验室操作；禁止用于人体或动物体内。所有样本、洗弃液、剩余试剂与耗材均按潜在传染性物质处理，按医疗废物规定高压灭菌或交由专门机构处置。终止液为0.5mol/L硫酸，具强腐蚀性，避免接触皮肤与眼睛；TMB对皮肤、呼吸道有刺激，操作应在通风环境并戴手套、护目镜。皮肤接触后立即用大量清水冲洗，必要时就医。试剂含防腐剂（如ProClin类），可能引起过敏反应，避免吸入挥发气体。不得用口吸移液；实验区禁止饮食、吸烟与存放食品；实验结束后彻底洗手。不同样本之间严格更换吸头，公共组分采用悬空加样，防止交叉污染导致假性升高。试剂盒组分不得与其他厂家或不同批号产品混用；过期、包装破损、标签不清的试剂禁止使用。检测废弃物与未使用的样本应按当地法规登记处置，不得随意丢弃或倒入下水道。13.方法局限性异嗜抗体干扰：样本中的人抗鼠抗体（HAMA）、类风湿因子或患者曾接受鼠源单克隆抗体治疗，可能造成假性结果。此类样本应用稀释法复核或改用其他方法学确认。生物素干扰：若产品采用生物素-链霉亲和素放大体系，患者服用高剂量生物素（如>5mg/日）可致结果假性偏低，采血前应停用至少8h并在申请单上注明。结构类似物交叉反应：孕酮、17α-羟孕烯醇酮、11-脱氧皮质醇等与17-OHP结构相近，浓度极高时可产生交叉反应；接受孕激素类药物治疗者结果需谨慎解读。生理与病理波动：新生儿出生后24～72h存在生理性升高，早产、低体重、应激、窒息可致假阳性；21-羟化酶缺陷以外的肾上腺疾病、肾上腺肿瘤及先天性肾上腺发育不良也可表现异常，结果不具病因特异性。样本因素：溶血、脂血、微生物污染、反复冻融、采血卡受潮或血斑量不足均可影响结果；干血斑血细胞比容异常（如贫血、红细胞增多）会改变洗脱效率。定量边界：低于检出限的结果报告为“低于检出限”，不得记为0；高于线性上限的结果须稀释复测。诊断边界：本产品不替代临床诊断。CAH的确诊需结合血17-OHP基础值与ACTH兴奋试验、电解质、血气、肾上腺影像及CYP21A2基因分析。14.常见问题与排查现象可能原因处理全板无显色酶结合物漏加或已失活；TMB失效；终止液误加在显色前核对加样记录，更换新批号酶结合物与底物重测空白孔A值偏高洗板不彻底、洗涤液稀释不足；底物被污染；拍板不干按1∶19重新配制洗涤液，增加浸泡30s，更换底物校准曲线平