选修三1.1《DNA重组技术的基本工具》.ppt

1、专题一基因工程,专题1.基因工程,1.1DNA重组技术的基本工具,1.2基因工程的基本操作程序,基因工程的发展史,1.3基因工程的应用,1.4蛋白质工程的崛起,科技探索之路,基础理论和技术发展催生了基因工程,20世纪中叶，基础理论取得了重大突破,1）.DNA是生物遗传物质的证明1944年艾弗里(O.Avery)等进行了肺炎双球菌体外转化实验,证明了DNA是生物的遗传物质,并且证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体,成为基因工程的先导,2）.DNA双螺旋结构和中心法则的确立。1953年沃森和克里克建立了双螺旋结构模型,使生物学进入分子水平。,1958年梅塞尔松和斯塔尔,以大肠杆菌为实

2、验材料,运用同位素示踪技术,用实验证明了DNA的复制是以半保留方式进行的.,3）.遗传密码的破译。1963年尼伦伯格和马太做蛋白质体外合成实验,破译编码氨基酸的遗传密码.1966年，霍拉纳用实验证明了遗传密码的存在。,随后不久确立了中心法则，揭开DNA复制，转录和翻译过程之谜。,1)基因转移载体的发现2)工具酶的发现,技术发明命使基因工程的实施成为可能：,1967年，罗思和赫林斯基发现细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力,并可在细菌细胞间转移，为基因转移找到一种运载工具.,1970年，阿尔伯、内森斯、史密斯在细菌中发现了第一个限制性内切酶。20世纪70年代初相继发现了多种限制酶，转录酶，为D

3、NA的切割，连接以及功能基因的获得创造了条件。,4)DNA体外重组的实现,1972年伯格(P.Berg)首先在体外进行了DNA改造的研究,成功地构建了第一个人工体外重组DNA分子.,3)DNA合成和测序技术的发明1965年，桑格发明了氨基酸序列分析技术,1977年，科学家又发明了DNA序列分析方法之后，DNA合成仪问世。,1973年博耶和科恩使重组DNA转入大肠杆菌中,转录出相应的mRNA,并使外源基因可以在原核细胞中成功表达,至此表明基因工程正式问世.,1973年称这“基因工程元年”，,科恩被称为基因工程发展史上的创始人,实验证明了质粒不仅可以作为基因工程的载体，重组DNA还可以进入受体细胞

4、，外援基因可以在原核细胞中成功表达。,5)重组DNA表达实验的成功,1980年第一个转基因小鼠问世,1982年采用显微注射技术培养目出”超级小鼠”,1983年培育出第一例转基因烟草,1988年穆里斯发明了PCR技术,使基因工程技术得到了进一步的发展和完善.获1993年诺贝尔化学奖,1993年中国农业科学院的科学成功之路地培育出抗棉铃虫的转基因抗虫棉,6)第一例转基因动物问世,7)PCR技术的发明,设想一,能否培养出具有抗虫性状的抗虫棉呢？,胰岛素是治疗糖尿病的特效药,长期以来只能从猪、牛等动物的胰腺中提取，产量低成本高。而微生物生长迅速，容易控制。于是科学家设想，若能将人的胰岛素基因导入微生物

5、体内，并得以表达，就不仅能解决产量问题，还能大大降低生产成本，使药品价格大幅下降。,设想二,能否让微生物产生出适合人的胰岛素等珍贵药物？,这些定向改造基因的设想能实现吗？,经过多年的努力，科学家终于在20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术基因工程,基因工程的产物,基因工程的概念：,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,剪

6、切,拼接,导入,表达,基因重组,基因工程的概念,定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的品种。,普通棉花抗虫棉,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,与运载体DNA拼接导入,棉花细胞(含抗虫基因),转基因棉花植株(有抗虫特性),上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？,解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？,“分子手术刀”限制性核酸内切酶,“分子缝合针”DNA连接酶,“分子运输车”运载体,1.1、DNA重组技术的基本工具,“分子手术刀”-“分子缝合针”-“分子运输车”-,限制性核酸内切酶DNA连接酶运载体,专一性，识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸

7、序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶。,约4000种。,1、来源：,2、种类：,3、特点：,5、结果：,形成两种末端,一、“分子手术刀”限制性核酸内切酶,切割DNA,4、作用：,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。,限制酶在原核生物中的作用：,寻根问底(P4),你能推测限制

8、酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？,限制酶的识别特点,以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称，重复排列如：GAATTCCCCGGGCTTAAGGGGCCC,（专一性）,大肠杆菌的一种限制酶（EcoR)能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开形成黏性末端。Sma能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切割形成平末端。,EcoR,黏性末端,黏性末端,中心轴线两侧切开,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,Sma,平末端平末端,中心轴线处切开,什么叫平末端？,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链

9、的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,思考与探究P7,为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,3、特点:,4、作用：5、结果：,1、简称：2、分布：,工具1：限制性核酸内切酶,主要在原核生物中,限制酶,识别特定核苷酸列,切割特定切点,（专一性）,切割DNA,产生黏性未端或平末端,小结,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性

10、(平)末端？,要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,思考?,Goback,GAATTCCTTAAG,GAATTCCTTAAG,EcoR,GAATTCCTTAAG,GAATTCCTTAAG,不同来源的DNA片段混合,将不同种来源的DNA片段连接起来,生物A基因片段,生物B基因片段,GAATTCCTTAAG,GAATTCCTTAAG,酶切,基因的针线：DNA连接酶,二、“分子缝合针”DNA连接酶,作用把2个DNA片段末端之间的缝隙“缝合”

11、起来。,限制酶切割后有两种不同的结果，一种产生黏性末端，一种产生平末端。那么恢复它们的连接时，所用DNA连接酶是否一样呢？,DNA连接酶的种类：,大肠杆菌,T4噬菌体,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,寻根问底(P6),DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?,将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,作用对象,DNA复制,基因重租,DNA连接酶与DNA聚合酶比较：,单链,双链,3、类型,E,coli,DNA,连接酶,来源：大肠杆菌,作用特点：只连接

12、黏性末端,T,4,DNA,连接酶,来源：,T,4,噬菌体,作用特点：连接黏性末端和平末端,2、作用原理：,催化磷酸二酯键形成,1、作用:：,工具2：DNA连接酶,把DNA片段拼接成新的DNA，,4、DNA连接酶与DNA聚合酶比较,小结,例.限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段:你是否能用DNA连接酶将它们连接起来？,和能连接形成,和能连接形成,和能连接形成,和能连接形成,反向对称,DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？,迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。,思考

13、与探究P7,要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去！能将外源基因送入受体细胞的工具就是载体。,基因工程的载体来源：,作为基因工程的载体需要怎样的条件呢？,质粒、噬菌体、动植物病毒,作用：将重组基因导入受体细胞,三、“分子运输车”基因进入受体细胞的载体,议一议,2、能否用SARS病毒作为基因载体？,3、作为载体，若没有切割位点将怎样？,4、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，如何鉴定？,5、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，将怎样？,1、从化学组成来看，载体应含有什么成分？,双链DNA,不能,不能进行DNA的重组,载体上应有标记基因,可能

14、造成基因丢失,1、载体必须具备的条件：能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；具有一至多个限制酶切点，以便与外源基因连接具有某些标记基因，便于进行筛选。如：抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。对受体细胞无害,2、常用的载体：质粒，噬菌体的衍生物，动植物病毒等,认识常用的载体质粒,质粒是基因工程常用的载体，一种裸露的、结构简单、独立于染色体或细菌拟核之外，能自我复制的小型环状双链DNA分子，对宿主细胞没有影响，主要存在于细菌和酵母菌体内。其中最常用的是大肠杆菌质粒。,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因,3、质粒,本质：小型环状DNA分子。,分布：许多细菌、酵母菌等生物,

15、质粒的特点：,1、细胞染色体（或拟核DNA分子）外能自主复制的小型环状DNA分子；2、质粒的存在对宿主细胞无影响；3、质粒的复制只能在宿主细胞内完成。,1、能自我复制2、具有一个或多个限制酶切点3、具有遗传标记基因4、对受体细胞无害、易分离5、大小适合，便于操作,质粒作为运载体的条件：,在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。,工具3：运载体,1、需要的条件：有1多个限制酶切点能在受体细胞中自我复制，或整合到受体细胞的染色体DNA上复制有某些标记基因，便于筛选对受体细胞无害2、常用运载体：质粒、噬菌体的衍生物或某些动植物病毒3、质粒：小型环状DNA分子

16、。,小结,天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？,不可以，作为基因工程使用的载体必需满足一定条件,且都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,思考与探究P7,原核生物很容易受到自然界中外源DNA的入侵，但是长期的进化过程中，这些原核生物却没有因为外源DNA的入侵而灭绝。根据我们刚刚掌握的知识，你能推测这其中的原因吗？,原核生物细胞中的限制酶会将外源DNA切割掉，使之失效，以保证自身的安全，但是不会切割自身的DNA，这是原核生物在长期进化过程中形成的一套防御机制。,寻根问底：,课本知识回顾,基因工程又叫做或。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种提取出来，加以，然后放到另一

17、种生物的细胞里，改造生物的遗传性状。,基因拼接技术,DNA重组技术,基因,修饰改造,定向地,DNA重组技术的基本工具,“分子手术刀”,“分子缝合针”,“分子运输车”,限制（性核酸内切）酶,DNA连接酶,基因进入受体细胞的载体,限制性核酸内切酶,主要是从的一种酶。识别双链DNA分子的某种，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的断开。形成两种末端,原核生物中分离纯化出来,特定的核苷酸序列,磷酸二酯键,粘性末端,平末端,“分子缝合针”DNA连接酶,1、种类：2、作用部位：,两类,连接黏性末端,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,磷酸二酯键,连接黏性末端和平末端,基因进入受体细胞的载体,通常

18、有三种:作为载体的条件：在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒都是在,质粒,噬菌体衍生物,动植物病毒,天然质粒,人工改造,的,能自我复制；有切割位点；有遗传标记基因；对受体细胞无害、易分离,基础上进行过,2和7能连接形成ACGTTGCA；4和8能连接形成GAATTCCTTAAG；3和6能连接形成GCGCCGCG；1和5能连接形成CTGCAGGACGTC。,教材P7思考与探究1,1、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（）同种限制酶B.两种限制酶同种连接酶D.两种连接酶,反馈练习：,2、不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制（）B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNA,4、下列说法正确的是：（）A、限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、重组技术所用的工具酶是限制酶、连接酶、运载体D、利用运载体在宿主细胞内对目的基因进行大量复制的过程可称为“克隆”,5.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）A、人工合成目的基因B、目的基因与运载体结合C、将目的基因导入受体细胞D、目的基因的检测和表达,6、关于限制酶的说法中，正确的（）A、限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序列B、EcoRI切割的是GA之间的氢键C限制酶一般不切割自身的DNA分子