吸光光度法课件

1、1,第八章:吸光光度法,基于物质光化学性质而建立起来的分析方法称之为光化学分析法。分为:光谱分析法和非光谱分析法。光谱分析法是指在光（或其它能量）的作用下，通过测量物质产生的发射光、吸收光或散射光的波长和强度来进行分析的方法。,吸收光谱分析发射光谱分析分子光谱分析原子光谱分析,2,8.1物质对光的选择性吸收和光吸收基本定律,8.1.1物质对光的选择性吸收,1光的基本性质光是一种电磁波，具有波粒二象性。光的波动性可用波长、频率、光速c、波数（cm-1）等参数来描述：=c；波数=1/=/c光是由光子流组成，光子的能量：E=h=hc/（Planck常数：h=6.62610-34JS)光的波长越短（频

2、率越高），其能量越大。白光(太阳光)：由各种单色光组成的复合光,3,光的电磁波性质,4,光学光谱区,5,单色光、复合光、光的互补,单色光,复合光,光的互补,单一波长的光,由不同波长的光组合而成的光,若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。,下一页,6,2.物质对光的选择性吸收,物质分子内部三种运动形式：（1）电子相对于原子核的运动（2）原子核在其平衡位置附近的相对振动（3）分子本身绕其重心的转动分子具有三种不同能级：电子能级、振动能级和转动能级三种能级都是量子化的，且各自具有相应的能量分子的内能：电子能量Ee、振动能量Ev、转动

3、能量Er即EEe+Ev+Erevr,7,能级跃迁,紫外-可见光谱属于电子跃迁光谱。电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。,8,吸收光谱AbsorptionSpectrum,纯电子能态间跃迁,分子内电子跃迁,带状光谱,锐线光谱,9,M+hM*,M+热,M+荧光或磷光,基态激发态E1（E）E2,E=E2-E1=h量子化；选择性吸收;物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础。用不同波长的单色光照射，测吸光度吸收曲线与最大吸收波长max；,光的互补：蓝黄,10,300,400,50

4、0,600,700,/nm,350,525545,Cr2O72-,MnO4-,Cr2O72-、MnO4-的吸收光谱,350,11,8.1.2光的吸收定律-朗伯比耳定律,透光度定义：,T取值为0.0%100.0%,全部吸收,T=0.0%,全部透射,T=100.0%,I0=It+Ia,吸光度：A=lg(I0/It)lg(1/T),全部吸收,全部透射,A=,A=0.00,朗伯定律（1760年）：光吸收与溶液层厚度成正比比尔定律（1852年）：光吸收与溶液浓度成正比,12,当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度及光程（溶液的厚度）成正比关系朗伯比尔定律,Alg(1/T)=Kbc

5、,其中，A:吸光度，T:透射比，K:比例常数，b:溶液厚度，c:溶液浓度,注意：平行单色光均相介质无发射、散射或光化学反应,13,摩尔吸光系数e,灵敏度表示方法,A=ebc,A=Kbc,c:mol/L,e表示物质的浓度为1mol/L,液层厚度为1cm时溶液的吸光度。单位：(Lmol-1cm-1),c:g/L,A=abca:吸光系数,14,桑德尔(Sandell)灵敏度：S当仪器检测吸光度为0.001时，单位截面积光程内所能检测到的吸光物质的最低含量。单位：mg/cm2S=M/e,15,8.2分光光度计吸收光谱,15,8.2.1分光光度计,光源,单色器,样品室,检测器,显示,1)光源在整个紫外光

6、区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。,可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在3202500nm。紫外区：氢、氘灯。发射185400nm的连续光谱。,1.基本组成,16,16,2)单色器,将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。入射狭缝：光源的光由此进入单色器；准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；,聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；出射狭缝。,17,17,棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同,单色器,18,18,光栅：在镀铝的玻璃表面刻有

7、数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。,原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光.,19,19,3)样品室,样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。4)检测器利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。,5)结果显示记录系统检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理,20,20,2.分光光度计的类型,1)单光束简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。,2)双光

8、束自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。,21,21,3)双波长,将不同波长的两束单色光(1、2)快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。=12nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。,22,测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长（）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制吸光度随波长的变化可得一曲线，此曲线即为吸收光谱。,8.2.2.吸收光谱,lmax：,max,基本名词,同一物质，浓度不同时，吸收光谱的形状相同，Amax不同定量分析的基础,23,23,参比溶液的选择,为什么需要使用参比溶液？

9、测得的的吸光度真正反映待测溶液吸光强度。参比溶液的选择一般遵循以下原则：若仅待测组分与显色剂反应产物在测定波长处有吸收，其它所加试剂均无吸收，用纯溶剂（水)作参比溶液；若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收，而试液本身无吸收，用“试剂空白”(不加试样溶液)作参比溶液；,若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收，则可用“试样空白”(不加显色剂)作参比溶液；若显色剂、试液中其它组分在测量波长处有吸收，则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，作为参比溶液。,24,8.3显色反应及其影响因素,8.3.1显色反应和显色剂,要求：a.灵敏度高(104)，选择性好b.产物的化学组成稳

10、定c.化学性质稳定d.反应产物和显色剂之间有明显的颜色差别(l60nm),没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量生成有色化合物再测定显色反应,1显色反应的选择,2.显色剂,无机显色剂:SCN-Fe(SCN)2+H2O2TiOH2O22+,有机显色剂:,与生色团相连时，会使吸收峰红移，吸收强度增强,生色团:含有*跃迁的不饱和基团,助色团:含非键电子的杂原子基团,26,有机显色剂,OO型：,ON型：,PAR,S型：,双硫腙,NN型：,丁二酮肟,邻二氮菲,磺基水杨酸,27,偶氮类：,三苯甲烷类：,结晶紫,铬天菁S,偶氮胂III,28,3.多元络合物,混配化合物Nb-5-Br-PADAP-酒石酸V-

11、PAR-H2O离子缔合物AuCl4-罗丹明B金属离子-配体-表面活性剂体系Mo-水杨基荧光酮-CTMAB,29,8.3.2影响显色反应的因素,1.溶液酸度（pH值及缓冲溶液）影响显色剂的平衡浓度及颜色，改变l影响待测离子的存在状态，防止沉淀影响络合物组成,pH对苯芴酮及其络合物的颜色影响,在相同实验条件下，分别测定不同pH值条件下显色溶液的吸光度。选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的pH范围。,30,2.显色剂用量吸光度A与显色剂用量CR的关系会出现如图所示的几种情况。选择曲线变化平坦处。,3.显色时间与温度实验确定4.溶剂有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率。一般尽量采用水相测定。5.干

12、扰离子的影响,31,8.4吸光光度分析及误差控制,1.测定波长的选择一般应该选择max为入射光波长。如果max处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。,8.4.1测定波长的选择标准曲线的制作,2标准曲线制作,理论基础：朗伯-比尔定律,相同条件下测定不同浓度标准溶液的吸光度AAc作图,33,33,8.4.2.对朗伯比耳定律的偏离,标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯比耳定律的偏离。引起这种偏离的因素非单色光引起的偏离；介质不均匀引起的偏离；化学反应引起的偏离。,1非单色光引起的偏移,复合光由l1和l2组成

13、，对于浓度不同的溶液a和b,引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲。,2.介质不均匀引起的偏离胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测吸光度增加，导致线性关系上弯曲,离解、缔合、异构等如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H+2CrO42-PAR的偶氮醌腙式,3.化学反应引起的偏离,36,4显色反应的干扰及其消除方法,3.,1）优化显色反应条件，控制溶液的酸度2）加入隐蔽剂3）改变价态4）选择适当波长5）选择合适参比溶液6）分离干扰离子,37,8.4.3.吸光度测量的误差（读数范围）,不同的透光度读数，产生的误差大小不同：A=lgT=bc微分

14、：dA=dlgT0.434dlnT=-0.434T-1dT=bdc两式相除得：dA/A=（0.434/TlgT）dT=dc/c以有限值表示可得：A/A=c/c=（0.434/TlgT）T浓度测量值的相对误差（c/c）不仅与仪器的透光度误差T有关，而且与其透光度读数T的值也有关。是否存在最佳读数范围？何值时误差最小？,38,最佳读数范围与最佳值,设：T=1%，则可绘出溶液浓度相对误差c/c与其透光度T的关系曲线。如图所示：当：T=1%，T在15%65%之间时，浓度相对误差较小，最佳读数范围。,用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在T%=1565%(吸光度A=0.80.2)。,可求出浓度相对误差最小时

15、的透光度Tmin为：Tmin36.8%,Amin0.434,39,8.5分光光度测定方法,8.5.1.普通分光光度法,1.单组分的测定目视比色法通常采用A-C标准曲线法定量测定。2.多组分的同时测定若各组分的吸收曲线互不重叠，则可在各自最大吸收波长处分别进行测定。这本质上与单组分测定没有区别。,若各组分的吸收曲线互有重叠，则可根据吸光度的加合性求解联立方程组得出各组分的含量。,A1=a1bcab1bcbA2=a2bcab2bcb,目视比色法,特点,利用自然光,比较吸收光的互补色光,准确度低（半定量）,不可分辨多组分,方法简便，灵敏度高,41,8.5.2、示差分光光度法（示差法）,普通分光光度法

16、一般只适于测定微量组分，当待测组分含量较高时，将产生较大的误差。需采用示差法。即提高入射光强度，并采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液。设：待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度为cs(cscx)。则：Ax=bcxAs=bcsxs=b(cxcs）=bc测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之差。,示差法测得的吸光度与c呈直线关系,由标准曲线上查得相应的c值，则待测溶液浓度cx：cx=cs+c,42,示差法标尺扩展原理：,普通法：cs的T=10%；cx的T=5%示差法：cs做参比，调T=100%则：cx的T=50%；标尺扩展10倍,43,例题,已知dT=0.01,样品Tx=2.

17、00%,标准Ts=10.0%,示差法,常规法误差,示差法误差,已知dT=0.01,样品Tx=2.00%,标准Ts=5.00%,44,8.5.3、双波长分光光度法,不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两束单色光(1和2)；以参比波长1处的吸光度A1作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提高。AA2A1(21)bc两波长处测得的吸光度差值A与待测组分浓度成正比。1和2分别表示待测组分在1和2处的摩尔吸光系数。,45,关键问题:,测量波长2和参比波长1的选择与组合以两组分x和y的双波长法测定为例：设：x为待测

18、组分，y为干扰组分，二者的吸光度差分别为:Ax和Ay，则该体系的总吸光度差Ax+y为：Ax+y=Ax+Ay如何选择波长1、2有一定的要求。,46,选择波长组合1、2的基本要求是：,选定的波长1和2处干扰组分应具有相同吸光度，即：Ay=Ay2Ay1=0故：Ax+y=Ax=(x2x1)bcx此时：测得的吸光度差A只与待测组分x的浓度呈线性关系，而与干扰组分y无关。若x为干扰组分，则也可用同样的方法测定y组分。,在选定的两个波长1和2处待测组分的吸光度应具有足够大的差值。,可采用作图法选择符合上述两个条件的波长组合。,47,双波长分光光度法消除浑浊背景干扰,12,A1-A2=AAc,例牛奶中微量Fe的测定,48,8.5.4、导数分光光度法,导数分光光度法在多组分同时测定、浑浊样品分析、消除背景干扰、加强光谱的精细结构以及复杂光谱的辨析等方面，显示了很大的优越性。利用吸光度(或透光度)对波长的导数曲线来进行分析：0e-bc假定入射光强度0在整个波长范围内保持恒定：dI0/d0则：dI/d0bce-bcd/dbcd/d,49,dI/dbcd/d一阶导数信号与试样浓度呈线性关系；测定灵敏度依赖于摩尔吸光系数对波长的变化率d/d。吸收曲线的拐点处d/d最大，故其灵敏度最高(见图）。同理可以导出其二阶和三阶导数光谱（略）,50,8.6分光光度分析法的应用,5.