植物病害检疫检验技术真菌

1、.第四章植物病害检疫检测技术，第一节植物检疫性真菌常见检疫检测技术，直接比重检测、染色检测、清洗检测、保湿、萌芽检测、分离培养检测，第一，适用范围在种子间混合的较大病原体(线虫痹、菌核)污染大量病原菌孢子的种子(小麦腥味黑穗病)种子明显的病粒(小麦黑胚病直接检查-肉眼检查小麦黑胚病粒、腥味黑穗病，检查时要先进行外表和周围的检查，然后从表里仔细观察病害症状、菌痹、菌核等病。 对于苗木、割穗、扦插等，需要注意茎、叶、芽、根的各部位，检查粘性和胶带的土壤。 对块茎、块根及鳞茎，特别要注意芽眼、凹陷处、伤口和附着的土壤。 主要工具：放大镜或解剖镜。 检测要求：2 .检测方法：将样品分成两半，放入白纸或

2、白色池塘的瓷器盘中，检测线虫痹、麦角菌、黑粉菌球、菌核和病粒，并测量其重量计算病害感染率。 3 .注意无症状的种子，不一定是无病的种子。 不同病害可以表示类似的症状，同样的病害也能引起不同的症状。 确定某种病害需要与其他方法并用。1、适用范围检查种子内混杂的大病原体，如菖蒲子、菌核、线虫痹和杂草种子等。 利用病原体和种子的形状、大小的差异，通过一定的网格筛选病原体，进行分类称量。 (二)通过筛子检查，对大豆莲丝有害，二、检查方法是将检查样品分成一半作为样品，用规定孔径的筛子通过筛子。 各层样品放入白瓷盘检查，最下层杂质放入黑玻璃盘用肉眼或放大镜检查。 病原体含量(%)=、病原体重量(g )、样

3、品重量(g )、100、筛选主要用于谷物、种子、油料、干燥结果和药材的检测。1、适用范围：种子表面生病肉眼看不到的种子病害。 (种子表面附着的病菌孢子)，(三)洗涤检查，小麦低腥黑穗病菌，洗涤检查法的原理：主要检查种子表面附着的各种真菌孢子。 种子表面经常附着真菌孢子，将一定量的样品放入容器中，加入一定量的无菌水，充分振动，清洗病原菌孢子，离心沉淀，可以用镜子检查沉淀物并确定其种类和数量。 主要仪器和试剂：振荡器、离心分离机、显微镜、0.1%吐温溶液等，2，检查方法：样品制备：将2份样品(5g )放入100ml三角瓶中，加入蒸馏水100ml (加入0.1%吐温溶液)，摇动510min，微计数：

4、悬浊液吸入上清液，留下1ml沉淀部分，滴入5片载玻片，加上盖玻璃镜检查，每片检查10个视野，计算每个视野的平均孢子数。 N=n1n2n3/m式中，每克种子的孢子负荷量n1-每视野的平均孢子数n2-每玻璃罩面积的视野数n3-1ml的水的滴数m-供试品的重量(g ) -清洗液进行镜子检查时，如果没有检测出病原菌孢子，对相同的样品1个样品采样2次，清洗检查的结果大不相同时，需要重复1次。 检查结果有4个影响因素： a .附着在种子和其他谷类产品表面的病原菌孢子不一定能完全清洗。 b .在离心管内，在悬浮液的表面上形成难以沉淀的孢子薄膜，管壁上也有可能附着孢子，检查结果难以表示实际的状况，影响计算的准

5、确性，c .如果将悬浮液滴加到玻璃板上，则孢子迅速沉淀，因此，视野间的孢子分布变得非常不均匀，这也影响计数的准确性如果d .操作不严格，就会导致人为的错误，试样调制也会出现偏差。原理：因为菌痹、菌核、病祈祷粒，比健康的种子轻。 泡在一定浓度的盐水(砂糖、土等)或其他溶液中，就会浮在液面上。捡起浮物，结合解剖镜检查，就能鉴定其种类。 (4)比重检测法、比重检测法一般检测种子、谷物、豆类中的菌痹、菌核和疾病的种子等。原理：在某些植物或植物器官病原感染后，或病原本身总是用特殊的化学药品处理，将其染成特有的颜色，有助于检测和区分病虫类的种类。 这个方法是染色检查法。 例如，马铃薯癌症(马铃薯片上的癌症

6、不明显时，作成徒手切片，加入1滴1%的“西藏花红”染色液，健康组织细胞壁呈明亮的红色，感染组织细胞壁呈暗红色。 麦类赤霉病检查：将病粒放入0.5-1%亚硝基胺溶液中，2-3小时内感染的部分和菌丝分布的部分从深红色呈咖啡色，未感染的部分为黄色，50的温度下颜色很清楚。 (5)染色检查法、解剖检查法在许多病害和病害开始发生阶段，如果种子、苗木和其他植物产品表面无明显症状，诊断困难时，需要通过解剖检查鉴定病原物潜伏的地方。 例如，黑穗病菌用菌丝体在胚中越冬，果树病害用菌丝体在花芽和鳞片中越冬。 解剖检查主要采用徒手切片或切片，经染色，制成玻璃片标本后，在显微镜下观察鉴定。 对一些病害、种子苗木及其产

7、品，有时也可以用粗放的解剖方法进行检测。 保湿萌芽检查的原理：种子所具有的真菌无论是附着在外表上，还是潜伏在种子内，在种子发芽的时候开始感染，种子未发芽时也会产生病原菌。 主要器械和试剂：吸水纸、砂土、冰箱、养护箱等。 通常的植物病理学方法、保湿萌芽检测方法： 1、保湿培养检测2、砂内萌芽检测3、土内萌芽检测4、试管幼苗症状检测、1 .保湿培养检测的方法一般分为吸水纸法、冻结吸水法、寒天平盘法等。 (1)吸水纸法广泛用于各种种子，包括谷类、豆类、麻类、香烟、各种蔬菜、观赏植物、树木种子等真菌病害检测。 吸水纸法的标准操作： a是三层无菌吸水纸，吸入无菌水后，滴下多馀的水，放入人消毒的培养皿中，

8、把种子放在吸水纸上。 b为了保持各粒种子间的距离一定，一般要控制在1-1.5cm以下，将培养皿放入适当温湿度的恒温槽中培养。 c在培养期间，每天交替处理12小时的光和暗，保持一定的周期。 d作物种子和病原菌一般在2-10d培养，种子表面出现被检病原菌，最后进行镜子检查。 优点：设备简单，应用范围广，操作方便，费用少，快速准确，容易掌握的被检病症立体感强，鉴定容易，标本制作容易等。 缺点：在这个条件下，真菌菌丝生长不旺盛，产孢子量少，很快就能生长成许多杂菌，超过或隐藏被检病原菌。 吸水纸法的特点：(2)冻结吸水法是一种改进的保湿培养法，其操作步骤如下： a种子排列在吸水纸上，一般谷物种子在10下

9、保持3d，先发芽。 在b20的温度下，保持2d (其他种子在20下保持4d )。 c再将幼苗在-20的温度下冷冻过夜，以死亡的幼苗作为培养基。 在d20的温度下对12h进行光/暗交替处理，保持了5-7d。 为了防止细菌污染，向吸水纸中加入抗生素，例如210-4赤霉素和赤霉素等几滴。 优点：病原物有利于孢子形成，同时避免了种子萌芽生长引起的相互垄断，容易检测。 (3)冷天平盘法，代替吸水纸，使用1.5%-1.7%琼脂，灭菌后放入无菌培养皿中，形成一定厚度的平面，这一点与吸水纸法不同。 优点：含水量均匀，有利于病原菌生长，盘内清洁，杂菌少，容易检测，常用于植物检疫检查。 寒天平皿法用于棉花枯萎、黄

10、萎病菌的检测。.把沙子用清水冲洗泥垢，用沸水煮后，放在用酒精和福尔马林消毒过的萌芽器中，冷却到含砂量的60%左右。 沙子比容器边缘低4cm，在平坦的沙子上排列种子，保持一定的距离。 种子排列后，再放入2-3cm细砂霸盖，放入容器盖，放入25的烘箱中。 第一个嫩芽的长度碰到顶盖的时候，请到罩子上去。 经过一定时期，可以把嫩芽连根取出，取出发芽的种子，根据幼苗和未发芽种子表现的症状和种苗有无孢子来计算发芽率和发病率。 2 .砂内萌芽检查，3 .土内萌芽检查，将种子播种到含有灭菌土壤的钵或播种箱中，保持适当的发芽温度、湿度。 种子发芽出土后，进行检查，分析发病情况。4 .测定试管幼苗的症状做成试管斜

11、面，每管放出一粒种子，堵塞喷嘴。 再放在20，用人工光和黑暗对半处理。 苗到达管顶后，可以卸下管盖。 培养期待后，检查幼苗的症状。 保湿萌芽检查的优点：容易检查根和绿部分，也能避免相互感染，但操作麻烦，一般可以用于检查珍贵的繁殖材料。 保湿萌芽检查的缺点： 1、在寄主生长不好、病原菌生长适宜的条件下，部分腐生菌成为萌芽阶段的寄生菌，可能在嫩芽上发生部分病斑。 2、主要依靠肉眼检查，很多病害可以发生类似的病，同一病害也可以发生不同的症状等，对检查结果的准确性有很大的影响。 (8)分离培养检测、分离培养主要用于检测种子、苗木或其他植物新产品内部潜伏的病原菌的种子、苗木、其他植物产品中有病斑，但没有

12、特殊病原菌的。 根据病原菌的不同，使用的培养基、分离方法、培养条件等也不同，必须因病适当使用。 通过分离培养得到的被检病原菌，必须按照必要的步骤慎重地鉴定。 分离真菌的方法有： 1、组织分离法：将样品材料表面消毒洗净后，切成小块，轻轻放在培养基平板表面上，写上标签后，可进行培养观察。 2、稀释分离法：将寄主组织受害部位的孢子洗掉制成悬浮液，稀释后与融化冷却的45左右的琼脂培养基混合，注入灭菌后的培养基中。 从种子、苗木和其他繁殖材料中获得的病原菌，有时可以接种到植株上，表现出典型症状后再进行鉴别。 (9)接种方法、病原的种类和传播方式不同，所以接种方法也各不相同，常用接种方法如下： (1)混合

13、接种：用病原菌孢子混合是接种黑粉症(例如低腥味黑穗病)的最常用方法。 (2)浸种接种：用病原真菌孢子悬浊液浸种也是常用的接种方法。 (3)花期接种法：主要用于从花期侵入的病原菌。 例如接种大麦、小麦散黑穗病菌。 抽穗后12日，用冬孢子悬浊液注射到花内。 (4)全株喷雾接种：向叶或茎部喷雾孢子悬浊液；(5)土壤接种法：以棉花枯萎、黄萎菌等感染土的病原菌为对象。 核酸技术是一种DNA分析鉴定技术，因为其方法快速准确，广泛应用于植物病原菌分类鉴定和亲缘关系分析等。 核酸技术基于PCR (聚合酶链反应)，是一种体外DNA扩增技术，具有其快速、准确、所需样品量少的特点，非常符合植物检疫检查过程的要求。

14、根据检疫对象，设计特异的引物，可以鉴定特定的病原菌。 (10 )核酸技术、隔离栽培检查难以发现症状和病原物，需要在生长阶段进行病害观察和分析鉴定。 隔离栽培要在温室和极其严密的隔离区进行，在各自的生长阶段进行观察。、对不同病害不同方法：1.2.3.4.5.对大病原体，通过筛子，肉眼可见种子外观有明显症状，表面未见带菌，清洗、滤纸培养、胚内病原菌、离体胚培养、种子内部病原菌、琼脂培养、肉眼、第二节植物病原细菌演讲：王晓东副教授已知的植物细菌病害都可以通过种苗传播，通过40%以上的种子传染病，正确检测种子和种苗是否具有检疫性原细菌，是预防此类病害的关键。 一、病原细菌的检测、植物病原细菌的检测方法

15、大致分为直接检测和间接检测。 直接检查：检查病原细菌时，病原物不被提取或分离。 间接检查：提取、分离、破坏病原细菌后进行检查。 分为活菌检查和非活菌检查。 (1)直接检查、1 .直观检查是以症状为主的田间检查，植物细菌病害的产地检疫主要是以这种方式进行的。 用肉眼观察植物的症状、菌脓、镜检，与田间的诊断结果一起作成。 快速诊断细菌性病害的方法-细菌溢出、2.生长检测：生长检测有实验室和田间幼苗症状检测两种。 (1)实验室检查：该检查将种子播种在湿润吸水纸或水琼脂培养基的平板上，根据幼芽和幼苗的症状进行初步诊断。 (2)田间幼苗症状检测：本法律总是受到环境条件的影响。 在植物检疫中，生长检查多作

16、为初步检查。 用.(2)间接检查、1 .活菌检查(1)分离培养法a分离病原细菌一般是稀释分离法。 稀释分离有以下两种方法。 培养皿稀释分离法取平板划线分离法、培养皿稀释分离法、平板划线分离法、小块病组织，用灭菌玻璃棒粉碎。 静置一定时间，用灭菌后的移植环将以上的组织液贴在琼脂平板上划线培养的平板的一侧依次画35条线，旋转培养皿对移植环灭菌后，从第2条线的末端依次画35条线。 目的是分离细菌形成分散的菌落。 观察传统的鉴定方法、培养性状对细菌的鉴定至关重要。 不同属植物病原细菌，其培养性状明显不同。 用培养液、琼脂斜面、琼脂平板观察培养性状。 说明时，指定培养基、培养时间、培养温度等。 通过细菌

17、的色素非水溶性色素：水溶性色素：细菌的形态，革兰氏染色法，阳性菌紫色阴性菌3354红色，鞭毛染色，产酸，产气，颜色变化等反应，测定细菌的耐性，好氧或厌氧，碳，氮和高分子化合物的利用和分解能力等，鉴定的目的常见的生化反应、糖发酵、甲基红试验、单糖发酵试验、蛋白质发酵、吲哚试验、硫化氢试验、其他试验、尿素酶试验、柠檬酸盐利用试验，目前发展了基于传统测定细菌生理生化指标的方法。 常见的有生化测定试剂盒、Biolog测定、甲基脂肪酸气相色谱分析法等。(2)浓缩接种和离体叶检定法，浓缩繁殖材料或种子提取液后，用注射、针刺、摩擦、剪叶或喷雾接种等方法，对感染的植物接种后是否发病及其症状特征进行观测，噬菌体检定，原理：噬菌体感染细菌，分解宿主细胞噬菌体具有特殊性，可以利用这一特征识别细菌的种类。 噬菌体是一种感染细菌的病毒，能寄生、繁殖于活着的细菌细胞，分解宿主细胞。 优点：噬菌体法简便、快捷，可以用种子提取液直接测定。缺点