直肠黏膜修复敷料生物学评价研究

1、直肠黏膜修复敷料生物学评价研究 自xx年6月1日起开始施行的医疗器械监督管理条例中明确提出guo家对医疗器械按照风险程度实行分类管理。第一类是风险程度低，实行常规管理可以保证其安全、有效的医疗器械。第二类是具有中度风险，需要严格控制管理以保证其安全、有效的医疗器械。第三类是具有较高风险，需要采取特别措施严格控制管理以保证其安全、有效的医疗器械1。根据xx年8月颁布的医疗器械分类目录，直肠黏膜修复敷料属于无源植入器械中的组织工程支架材料，属类器械2。按照GB/T系列标准3-6对直肠黏膜修复敷料进行了细胞毒性、迟发型过敏及刺激等生物学评价，以期为进一步的临床研究提供依据，现报道如下。 1.1一般资

2、料 供试品：直肠黏膜修复敷料，A、B、C三个厂家生产，共三批。材料、药品、试剂：高密度聚乙烯，批号：K0M357，美国药典委员会；氯化钠注射液，批号：1601303G，西安京西双鹤药业有限公司；优级胎牛血清，货号：TBD21HY，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；RPMI培养基，批号：AB10125297，HyClone；青链霉素混合液（100），批号：xx0503，Solarbio；胰蛋白酶，批号：SLBP8607V，Sigma；苯酚，批号：xx0317，国药集团化学试剂有限公司。细胞及动物：细胞株，L929细胞，武汉博士德生物工程有限公司。白化豚鼠、新西兰兔，由西安市迪乐普生物资源开发有

3、限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（陕）xx-001。饲养环境：温度2226?C，相对湿度40%70%，实验动物使用许可证号：SYXK（陕）xx-00。仪器：电子天平，BS2202S，赛多利斯仪器有限公司；生化培养箱，BSP-250，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；低速台式离心机，KA-1000，上海安亭科学仪器厂；医用净化工作台，SW-CJ-2F，苏州安泰空气技术有限公司司；CO2培养箱，HF151，上海力康医疗设备有限公司；倒置相差显微镜，XSZ-D2，重庆光学仪器厂。 1.2方法 1.2.1迟发型超敏反应封闭贴敷试验4诱导：试验前剔除豚鼠背部被毛。豚鼠30只作为试验组，5只作为对

4、照组。取供试品用吸收性纱布浸透1mL，贴敷于如图1所示诱导部位，纱布覆盖，绷带固定，贴敷6h。1周中连续3d重复该操作，同法操作3周。对照组以氯化钠注射液同法操作。见图1。激发：最后一次诱导后14d，对所有豚鼠于图1中的激发部位进行激发，方法同，贴敷6h。24h后剔除激发部位及周围被毛，温水洗净擦干，脱毛后至少2h，按表1对试验部位评分，并于48h再次评分。见表1。1.2.2体外细胞毒性试验（MTT法）3,5,6试验样品及试液的制备：供试液：无菌条件下将直肠黏膜修复敷料与含血清培养基按0.2g/mL的比例于37?C浸提24h后2000r/min离心3min，取上清。阴性对照液：取高密度聚乙烯（

5、厚度为1mm）36cm2，剪成5mm25mm的小块，加12mL细胞生长培养液，37?C浸提24h，过滤除菌。阳性对照液：5g/L苯酚溶液，过滤除菌，现用现配。空白对照液：同细胞生长培养液。方法：取6块96孔培养板，每板各设6孔，每孔接种100L处于对数生长期状态良好的L929细胞混悬液，密度为1104个/mL。置5%CO2培养箱37?C培养24h后，弃去原生长培养液。1-3#板各加100L供试液，作为供试品组；4#板加100L空白对照液，作为空白对照组；5#板加100L的阳性对照液，作为阳性对照组，6#板加100L的阴性对照液，作为阴性对照组，置CO2培养箱继续培养72h。72h后，取出各板，

6、置显微镜下观察细胞形态，每孔加入20L质量浓度为5g/L的MTT溶液，继续培养4h后弃去孔内液体，每孔加入150LDMSO，振荡10min，在酶标仪570nm和630nm波长下测定吸光度，按下式计算相对增值率（RGR）。RGR=A/A0100%注：RGR相对增值率，%；A供试品组（阳性及阴性对照组）在570nm和630nm波长下的吸光度的差值；A0空白对照组吸光度。根据RGR按表2判定毒性反应分级。见表2。1.2.3黏膜刺激试验4选取直肠无明显刺激症状、无缺陷和无损伤的家兔12只，供试品组及对照组各3只。供试品组将受试物原液1mL注入至直肠内，对照组以氯化钠注射液1mL同法处理。每隔24h连续

7、重复上述操作，连续5d。观察记录会阴溢液、红斑及刺激情况。给药结束后解剖出直肠组织，观察黏膜上皮组织。于注射部位取材，常规石蜡包埋切片，HE染色，LEICA生物显微镜观察。按表3记录每只动物病理反应评分，按表4进行刺激反应程度分级。见表3、表4。 2.1迟发型超敏反应试验结果 于激发后24h及48h观察，供试品组及对照组中豚鼠的反应等级均为0，表明三批直肠黏膜修复敷料在本试验条件下对豚鼠皮肤无致敏反应，结果见表5。 2.2体外细胞毒性试验结果 结果表明在本实验室条件下，阳性对照组细胞毒性反应级别为4级，阴性对照组细胞毒性反应级别为0级，直肠黏膜修复敷料A和C的细胞毒性反应级别2级，B的细胞毒性

8、反应级别1级，结果见表6。 2.3黏膜刺激性试验结果 病理检查结果显示：对照组黏膜层上皮结构完整，固有层可见轻到中度炎细胞浸润及极轻度水肿，未见明显血管充血，平均刺激指数为3.33；试验组黏膜层上皮结构完整，固有层可见重度炎细胞浸润，少数血管充血及极轻度水肿，平均刺激指数为试验组（A）5.33，试验组（B）6.67，试验组（C）5.33。结果表明在本实验室条件下，三批直肠黏膜修复敷料均具轻度刺激，对照组具极轻度刺激。病理检查结果见图2，反应计分及程度见表7。 医疗器械的生物学评价是在器械应用于人体之前先模拟体内、体外生物学试验，再根据实际需要进行动物体内实验，经数据分析和信息汇总后进行安全性评

9、估，最终对该器械应用于人体的风险性做出预判。其意义在于预测医疗器械在与人体接触使用过程中的潜在危害，将风险性减少到最低的程度，确保使用的安全性7。医疗器械的生物学评价是确保人体应用安全的重要前提，但其本质是一项预测性工作，由于体外与体内的情况不能完全等同，动物与人体也存在差异，因此用体外试验的结果来推测体内的应用状况，用动物试验得来的结果去推测人体应用的安全与否，是有可能会出现某些偏差的8。正是由于医疗器械生物学评价的特殊性及局限性，所以不能简单地只以某一项试验结果就做出判断，而是应该建立在综合考虑分析的基础上去做整体评价。虽然现在业内已有了一系列的评价标准及方法，但是由于材料科学和医学科学的

10、迅猛发展，各种类型的医用产品不断问世，现有的标准或方法还不足以完全适应安全性评价的需求，这将是当下医疗器械的安全性评价领域需要面对和思考的问题。本文综合了GB/T16886及GB/T14233的系列标准，对三批直肠黏膜修复敷料进行了生物安全性评价，结果均符合规定。初步认为三批直肠黏膜修复敷料用于临床是安全的。 1 _.医疗器械监督管理条例Z.xx-03-07. 2国家食品药品监督管理条例.医疗器械分类规则Z.xx-07-14. 3中华人民 _国家质量监督检验检疫总局/中国国家标准化管理委员会.中华人民 _国家标准医疗器械生物学评价第12部分:样品制备与参照样品S.xx:4-8. 4中华人民 _国家质量监督检验检疫总局/中国国家标准化管理委员会.中华人民 _国家标准医疗器械生物学评价第10部分:刺激与迟发型超敏反应试验S.xx:14-16,25-30. 5中华人民 _国家质量监督检验检疫总局/中国国家标准化管理委员会.中华人民 _国家标准医疗器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试验S.xx:84-88. 6中华人民 _国家质量监督检验检疫总局/中国国家标准化管理委员会.中华人民 _国家标准医用输液、输血、注射器具检验方法第2