报告基因分析技术相关实验技术资料

1、报告基因分析技术一、报告基因报告基因(reporter gene)是指其表达产物易被检测，且易与内源性背景蛋白相区别的基因。报告基因技术是通过把已确定的顺式调控序列剪接到报告基因上来控制基因的活性，这些反应元件可以对宿主细胞中基因调控和表达的变化起反应，从而就可以直观地“报道”细胞内与基因表达有关的信号级联。报告基因的优点是细胞内背景活性低，而且可以将细胞表面的信号放大,产生一个高敏感、易检测的反应。报告基因的选择依赖于所使用的细胞系和实验的性质，以及对相应检测方法的可行性。报告基因通常是在报告基因载体质粒中与被检测基因序列相连, 先让质粒在大肠杆菌中进行增殖, 再提取质粒, 转染入感兴趣的真

2、核细胞中。作为报告基因必须具备以下特点：1、由原核基因编码的基因产物必须与同转染前真核细胞内任何相似的产物相区别；2、细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的检测；3、报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵敏度高而且重现性好。报告基因的种类很多，根据对其表达产物的分析检测方法的不同，可将其分为体外报告基因和体内报告基因。前者的分析需要在含有报告分子的细胞裂解液或细胞、组织培养液（分泌型报告基因）中进行报告分子的定量。较典型的有氯霉素乙酰基转移酶基因（CAT）、人生长激素基因（hGH）及分泌型碱性磷酸酶基因（SEAP）等。后者的分析可以在活的细胞或组织中，或在已经组化固定的组织或细胞中进行

3、。较典型的如绿色荧光蛋白基因（GFP）。而-半乳糖苷酶基因（-Gal）和萤火虫荧光素酶基因既可以在体外分析也可以在体内分析。二、报告基因的种类2.1 氯霉素转乙酰酶报告基因 ( chlormnphenicol acetyltransferase, CAT) 氯霉素转乙酰酶报告基因 (CAT)：该报告基因来源于大肠杆菌转位子9，是第1个用于检测细胞内转录活性的报告基因。氯霉素乙酰基转移酶可催化乙酰CoA的乙酰基转移到氯霉素3羟基，而使氯霉素解毒。CAT在哺乳细胞无内源性表达，性质稳定，半衰期较短，适于瞬时表达研究。可用同位素、荧光素和酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorb

4、antassay，ELISA）检测其活性，也可进行蛋白质印迹（Westernblotting）和免疫组织化学分析。CAT与其他报告基因相比，线性范围较窄，灵敏性较低。检测方法：1. 转染后 2472 h，用 D-PBSA 液洗涤细胞。2. 将培养板置于冰上，每孔中加入 1 mL 的 Tris/Triton。3. 将培养板-70 冷冻 2 h。4. 于 37 下解冻培养板，然后将其置于冰上。5. 将细胞裂解物移至微量离心管中，以最大速度离心 5 min。6. 收集上清液，65 加热 10 min，以灭活 CAT 抑制物质。7. 最大速度离心 3 min 后收集上清液（细胞裂解物），将上清液保存在

5、-70。8. 从每一样品中取 5150L 细胞裂解物，移至一个 3.5 mL 多聚丙烯闪烁杯中，并且加入足够的 0.1mol/L Tris，终末体积为 150L。9. 设空白杯，加入 150L 0.1mol/LTris 液，作为阴性对照。10. 阳性对照：（a）取 5 个闪烁杯，各加入 150L 0.1mol/LTris。（b）将 5L 的 CAT 标准液加入到每个闪烁杯中，绘制 1、5、10、20、50mU 的 CAT 标准曲线。11. 在所有样品杯（包括对照）中，加入 100L 以下混合液：（a）84L 超纯水（b）10L 0.1mol/LTris（c）1L 的氯霉素（d）5L（50nCi

6、）的14C-CoA12. 拧紧杯盖，于 37 下孵育 2 h。13. 向所有闪烁杯中加入 3 mL Econofluor，拧紧杯盖。14. 上下倒置混匀闪烁杯中成分。15. 室温下孵育 2 h。16. 在一个液闪计数仪上测定 30s 闪烁次数。注意事项：1. 在表达质粒扩增与制备一步，要特别注意其纯度（不能含RNA和染色体DNA）以免影响转化效率2. 制备方法最好选用溶菌酶加Triton10，然后氯化艳梯度离心。3. 一定要有对照组用CAT酶代替细胞提取液，来验证反应及层析等过程的可行性，或用Psv:CAT和Psv。cAT表达质粒验证转化及重组两步的正确性。4. 在制备细胞提取液中最好选用超声

7、波破碎法，离心前要注意检查破碎程度。冻融法繁琐有时破碎不彻底影响结果。5. 4mmol/L乙酞辅酶A可每次取1.smg溶在500纯水中，最好用前配制，配制的溶液可保存于一20，但不可超过十天。常见载体：2.2 人生长激素基因（hGH）报告基因人生长激素基因（hGH）：是由人脑垂体前叶分泌的一种多肽，属于分泌型报告分子，可直接检测蛋白水平，可以在96孔板内进行高通量分析，操作简单。检测方法：人生长激素ELISA试剂盒1、取转染细胞上清液，加入准备好的样品和标准品，37反应60min2、洗板2次，加入生物素化人ANG抗体工作液，37反应60min3、洗板3次，加入ABC工作液，37反应30min4

8、、洗板5次，加入TMB显色液，37反应5、加入TMB终止液6、30min内读OD值7、计算样本中待测因子的含量2.3 分泌型碱性磷酸酶基因（SEAP）报告基因分泌型碱性磷酸酶基因（SEAP）：是人胎盘碱性磷酸酶的突变体，无内源性表达。SEAP缺乏胎盘碱性磷酸酶羧基末端的24个氨基酸。其优点是无需裂解细胞，只用培养介质即可检测酶活性，便于进行时效反应试验。以间硝基苯磷酸盐（PNPP）为底物时可用标准的比色法测定酶活性，操作简单，反应时间短，价格廉价，但灵敏度低。以黄素腺嘌呤二核苷酸磷酸为底物进行比色测定，其灵敏度增高。SEAP可催化D-荧光素-O-磷酸盐水解生成D-荧光素，后者又可作为荧光素酶的

9、底物，此即两步生物发光法检测酶活性的原理。此方法灵敏度高，接近于荧光素酶报告基因的检测。还可用一步化学发光法检测酶活性。检测步骤：常见载体：2.4 绿色荧光蛋白(GFP)报告基因绿色荧光蛋白(GFP)是应用最多的发光蛋白。是一类存在于腔肠动物体内的生物发光蛋白。易于检测，灵敏度高；荧光性质稳定，耐受性强；易于表达，无细胞毒性；可用于活细胞检测。因此，GFP可作为报告基因用于检测基因表达或调控，或作为融合标签来检测蛋白质分子的定位、迁移、构象变化以及分子间的相互作用，或者靶向标记某些细胞器。用395 Bin的紫外线和475 nm的蓝光激发，GFP可在508nm处自行发射绿色荧光，无需辅助因子和底

10、物。GFP最大的优势是无需损伤细胞即可研究细胞内事件。1991年克隆了GFP基因，已获得几个突变体，如“红色迁移”突变体（redshiftmutant），其荧光更强。其他突变体还有蓝色荧光蛋白（BFP）、增强型GFP(EGFP）和去稳定EGFP(destabilized EGFP）等。红色荧光蛋白（RFP）是从珊瑚（Discosoma sp）中分离的发光蛋白（drFP583或DsRed），可发射明亮的红色荧光。这些常用的报告基因也可被联合应用，同时检测2个甚至3个基因的表达。报告基因的选择依赖于其灵敏性、可靠性及监测的动力学范围。稳定性好的报告基因适于基因转录动力学研究和高通量筛选，尤其适用于

11、基因转移的定性研究。检测方法： 定性检测：可以用常规的落射荧光显微镜或者共聚焦显微镜观察； 定量检测：免疫印迹法、酶联免疫吸附法 可以在活细胞中进行图像分析，也可以检测固定细胞中GFP常用载体：2.5 -半乳糖苷酶基因（-Gal）报告基因-半乳糖苷酶：由大肠杆菌lacZ基因编码，可催化半乳糖苷水解。最大优势是易于用免疫组织化学法观测其原位表达，是最常用的监测转染率的报道基因之一。以邻-硝基苯-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）为底物可用标准的比色法检测酶活性，其检测动力学范围为6个数量级。氯酚红-D-半乳吡喃糖苷（CPRG）是另一个可用比色法检测酶活性的底物，其灵敏度比ONPG高近10倍。以MUG和

12、荧光素二半乳糖苷（FDG）为底物则可用荧光法检测其活性。此法可检测单个细胞的酶活性，并可用于流式细胞学（FACS）分析。如以二氧杂环丁烷为底物，可用化学发光法检测酶活性，其检测动力学范围最大，灵敏度最高，与用生物发光法检测荧光素酶活性的灵敏度相似。半乳糖苷酶是动物和微生物基因工程中最常用、最成熟的一种报告基因。-半乳糖苷酶基因作为报告基因的应用主要有以下几个方面： 用于研究启动子的效能和启动子不同位点突变对表达效能的影响； 用于研究表达系统中增强序列等调控序列的功能； 用来衡量载体的表达特性和外源物质对表达调控的影响； 以融合基因的形式用于研究外源基因的表达及其规律。检测方法：1.用转染的细胞

13、制备细胞抽提物。2. 对于每个用于测定的转染细胞裂解物样品，混合： 100xMg2+溶液 3ul 1xONPG 66ul 细胞抽提物 30ul 0.1mol/L 磷酸钠（PH7.5) 201ul3. 反应液在 37C 孵育 30 min 或者直到淡黄色出现。大多数细胞类型中，内源性-半乳糖苷酶的背景非常低，允许孵育时间长到 46 h。4. 每管加入 500ul 1mol/L Na2CO3使反应终止。在分光光度计上读 420nm 波长的光密度值。常用载体：2.6 荧光素酶（Luc）报告基因荧光素酶报告基因是指以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflylucifera

14、se)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。荧光素酶是能够催化不同底物氧化发光的一类酶，哺乳细胞无内源性荧光素酶。最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶。细菌荧光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。萤火虫荧光素酶灵敏度高，检测线性范围宽达78个数量级，是最常用于哺乳细胞的报道基因，用荧光比色计即可检测酶活性，因而适用于高通量筛选。随着具有膜通透性和光裂解作用的萤火虫荧光素酶的应用，无需裂解细胞即可检测酶活性。Renilla

15、荧光素酶催化肠腔素（coelenterazine）氧化，产物可透过生物膜，可能是最适用于活细胞的报告分子。将荧光素酶报告基因载体转染到细胞中，可用荧光素酶检测系统灵敏方便地测定荧光素酶基因的表达。自1986年起，萤火虫荧光素酶基因被用作测定基因表达的报告基因，获得了广泛的应用。Promega公司的pGL3及pGL2系列载体，含SV40启动子及增强子的不同组合，有助于分析DNA片段的转录活性。荧光素酶报告基因有许多优点：非放射性；比CAT及其他报告基因速度快；比CAT灵敏100倍；荧光素酶在哺乳细胞中的半衰期为3小时，在植物中的半衰期为35小时。由于半衰期短，故启动子的改变会即时导致荧光素酶活性

16、的改变，而荧光素酶不会积累。相反，CAT在哺乳细胞中的半衰期为50小时。荧光素酶浓度在1016mol/L（10pS/L）到10-8mol/L（1mg/L）范围内，荧光信号强度与酶浓度成正比。在理想条件下，可检测到l0-20mol/L的荧光素酶。检测步骤：（1） 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。（2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3-basic）中。（3）筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。（4） 扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用。（5） 培养293（或其它目的

17、细胞），并接种于24孔板中，生长10-24小时（80%汇合度）。（6） 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。（7） 提取蛋白并用于荧光素酶检测。（8） 加入底物，测定荧光素酶的活性。（9） 计算相对荧光强度，并与空载对照比较。具体实验步骤：注：该操作流程通常用来检测转染了萤火虫荧光素酶基因的真核细胞中荧光素酶表达的活性，不适用于对细菌荧光素酶进行检测。1实验第一天，消化并接种细胞（根据具体实验选择合适的细胞）于35mm细胞培养皿，置于5CO2、饱和湿度的37培养箱内培养过夜。2等细胞密度达到70时用Luciferase报告基因质粒、LacZ的表达质粒及其它质粒（根据具体实验确定）共转染

18、细胞（根据具体实验选择转染方法，如磷酸钙沉淀法、PEI、lipofectamine2000等均可）。3转染2436h后，吸去培养液，用预冷的PBS（无钙和镁离子）洗涤细胞。注：荧光酶的酶促反应会被痕量的钙所抑制，故用磷酸钙转染的细胞在收集细胞前应充分洗涤除去含钙介质。4在每个培养皿中加入350l预冷的harvest buffer,于4 或冰上放置10min裂解细胞。5在细胞裂解期间，准备足量的1.5 ml微量离心管，将ATP buffer 与luciferinbuffer 以1：3.6比例混合成反应液后分装，每管100l。6依次取等体积的细胞裂解液（100l）至步骤5中的离心管中，迅速混匀，在

19、发光仪（Luminometer）上读取吸光值。注：发光反应会迅速衰减，将细胞裂解液加入反应液后5s内必须读取吸光值。7确保以相同操作手法读取全部样品吸光值后。8取剩余裂解液测定LacZ的活性，其读数作为内标用以矫正荧光素酶的读数。9. 用矫正后的读数作图，分析数据。注：荧光素见光易氧化，已稀释未用的荧光素应丢弃。注意事项：1.荧光素酶检测试剂需在15-25条件下预平衡后再进行反应，而后依据具体条件进行自动或手动检测。当用液闪计数仪时，加入荧光素酶检测试剂后立即轻轻混匀。2.如果细胞裂解后不能立即对提取物进行检测，样品可以在冰上保存大约5h，在-70可保存数月。不要反复冻融以避免酶活性的降低。3

20、.利用上述方法检测冷的样品时，其信号强度将下降5-15%。4.在荧光素酶活性较高的情况下，导致信号超出线性范围（信号溢出）可用裂解液将样品进行稀释。5.不要储存稀释过的样品。如果必须保存，要在稀释的样品中加入BSA至终浓度为2.5mg/ml，这样可以保持样品的稳定性。6.一些荧光仪在进行检测前需要1-2s的稳定，因此建议在开机后过一段时间再进行检测操作。常用载体：三、常用的报告基因优缺点比较：1.氯霉素乙酰基转移酶（CAT）：适用于体外荧光或免疫检测，不适合用于体内分析。优点：哺乳动物中内源性活性极小，蛋白稳定，有不同的分析方法。缺点：mRNA半衰期短，操作繁琐，线性范围较窄。2.人生长激素基

21、因（hGH）：适用于体外放射免疫分析，不适合用于体内分析。优点：属于分泌型报告分子，可直接检测蛋白水平，可以在96孔板内进行高通量分析，操作简单。缺点：需要用125I分析，增加安全危险，灵敏度相对低，费用昂贵，线性范围小。3.分泌型碱性磷酸酶（SEAP）：适用于体外生物发光或化学发光分析，不适合用于体内分析。优点：非放射性，分泌型报告因子，化学发光检测可以有大的线性范围，有利于在96孔板内进行高通量检测。缺点：不适用于低水平胎盘型碱性磷酸酶的细胞，不适用于分析分泌功能实验。4.绿色荧光蛋白（GFP）：适用于体内荧光检测，不常用于体外分析。优点：报告或细胞内基因表达和细胞内定位，荧光发射无种属依赖性，不需要陪附加基因产物、底物或辅助因子，高的抗荧光漂白特