人胚胎干细胞研究进展课件

1、人胚胎干细胞研究进展,南京医科大学组织胚胎教研室 江苏省生殖医学重点实验室 周作民,干细胞的基本概念 胚胎干细胞系的建立过程 胚胎干细胞研究的进展情况 胚胎干细胞的研究意义 胚胎干细胞研究的困难及解决办法,人体发生过程： 受精 卵裂 受精后72h 受精后5-7天 精子+卵子 合子 卵裂球 桑椹胚 囊胚 滋养层胎盘及胎儿附属结构 囊胚 内胚层消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。 内细胞群 中胚层结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统 外胚层体表结构；神经系统,干细胞的基本概念,1、定义：具有自我复制的能力，在一定条件下能够分化成各种功能细胞。 2、分类： （1）全能干细胞，包括：胚胎干细胞（

2、embryonic stem cells, ES细胞） 生殖干细胞（embryonic germ cells, EG细胞） 具有全能性，能够分化成全身200多种细胞类型， 进一步形成机体的任何组织和器官。 （2）多能干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发 育成完整个体的能力。 （3）专能干细胞：只能向一种或密切相关的两种类型的细胞分化。,横向分化： 部分干细胞在特定条件下可以转化为其它细胞，如肌肉干细胞在特定条件下可以分化为各种血细胞系。,衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞； 永生化(immortal)； 能维持稳定的正常的二倍体染色体结构； 有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或

3、分化； 能参与胎儿所有组织的发育过程；,胚胎干细胞的性质,胚胎干细胞系的建立过程,1、干细胞来源： (1) 发育良好的囊胚，从中分离内细胞群细胞ES细胞 (2) 从5-9周的胚胎生殖腺中分离出人的EG细胞（embryonic germinate cells） (3)恶性胚胎肿瘤或畸胎瘤细胞 （embryonal carcinoma, EC) (4) 生殖克隆（治疗性克隆）：体细胞核转移（SCNT） 去核卵细胞 + 体细胞核 克隆 囊胚 分离内细胞群 ES细胞,2、胚胎干细胞的分离 酶消化后培养 免疫方法去处滋养层细胞 流式细胞仪分离法,3、培养条件： (1) 特殊的培养液：用DMEM培养液，其

4、中胎牛血清的浓度和质量很重要，还要加非必须氨基酸；-巯基乙醇。 (2) 以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养细胞。 (3) 必须加入LIF，抑制细胞分化。,4、胚胎干细胞的鉴别 胚胎干细胞具有以下特点： (1) 细胞内碱性磷酸酶活性高 (2)端粒酶活性高 (3) 不被Hoechst33342 和Rhodamine123染色 (4) 细胞膜表面有特殊的标记：SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 (5) 能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植 入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤 (6) 可诱导分化为各种成体干细胞,干细胞特性,干细胞诱导分化的常用方法 （1）加入诱导细胞分化的因

5、子或化学物质， 如VGEF、bFGF 、DMSO和RA等 （2）将ES细胞与特定的细胞共培养 （3）将某种分化诱导因子的基因转入ES细 胞内,鉴定干细胞的常用方法： （1） 细胞形态与结构 （2）细胞功能 （3）细胞表面的特殊标志 （4）细胞内特异基因的表达,造血干细胞的鉴定： （1） 细胞形态 ：集落呈非贴壁生长，细胞形态较小 （2）细胞表面标志：flk-1（Fetal Liver Kinase 1); L/TAL-1； CD34；GATA-1； （3）基因表达：TAL-1；GATA-2 ；H1；主要珠蛋白,内皮细胞 : （1）细胞形态：扁平贴壁状态 ；Weibel-Palade小体；广泛胞

6、内连接；大量吞饮泡 （2）细胞标志：血小板内皮细胞粘附分子PECAM-1或CD31；细胞粘附分子整合素v3 ；CD34 ；JAM(Junctional Adhesion Membrane) ；MECA-32以及MEC-14，7抗原 （3）特异基因表达：flk-1；flt-1 ；tie-2,心肌干细胞： （1）细胞结构：细胞内含糖原颗粒，大量线粒体以及广泛的未形成成熟肌原纤维的粗丝和细丝 （2）细胞功能：节律性收缩 ；心肌特异离子流。利用膜片钳技术可检测L型Ica，Ina，Ito，Ik，Ik1，Ik，ACH和If （3）基因表达：及心肌球蛋白重链,神经干细胞 : （1）细胞形态：胞体很小，从胞体

7、伸出许多长的神经突 （2）细胞功能：电压控制性Na+，K+，Ca2+通道；神经递质的受体 （3）细胞标志：TH（酪氨酸羟化酶），微管相关蛋白tau，MAP2，微管蛋白3（TuJ-1），GFAP（胶质原纤维酸性蛋白），巢蛋白，突触泡蛋白以及NF-L（68KDa的神经丝蛋白），NF-H（200KDa的神经丝蛋白），NF-M（160KDa的神经丝蛋白）；Nurr1和Ptx3（中脑多巴胺能神经元的标志） （4）特异基因表达：5天的EBs中有NF-L，NF-M和突触泡蛋白的表达，2天后表达编码神经聚糖（脑特异蛋白多糖）的基因，6天后表达编码微管相关蛋白tau的基因。也有检测发现分化细胞中有Brain-3

8、，谷氨酰胺受体亚单位GluR-4和GluR-6，递质合成酶TH和GAD67，GAD65，GFAP和NF-L的表达,胰岛细胞 : 细胞标志：GATA-4（胚胎和胚外内胚层的标志），HNF3（胚胎内胚层的标志）；胰岛素淀粉样多肽IAPP；葡萄糖转运蛋白-2（Glut-2） ； 胰岛细胞的特征及特定标记物：胰岛GK和GLUT2（葡萄糖转运子）；转录因子IPF1/PDX1和NgN3（Neurogenin3）,2002年3月，美国麻省理工学院的科学家宣布，他们首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力。 目前已有报导ES细胞能在适当条件下分化为心肌细胞，胰岛细胞，血管内皮细胞，肝细胞等。,1999年12月，美国科学杂志公布了当年世界科学进展的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗资巨大的人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。,解决胚胎来源有限的途径： 未成熟卵的体外成熟,避免免疫排斥的方法 （1）Knock-out 胚胎干细胞的组织相 容性抗原 （2）Knock-in 受者的组织相容性抗原 （3）与同一来源的造血干细胞一同移植 （4）受者