大黄素的高效提取及其NMR结构探索研究

1、- - 1 2 6 - - 南京中医药大学学报2 0 1 0 年3 月第2 6 卷第2 期 j o b r ：t l o f n a n f l n gt c m u n i t e r s i t yv 0 1 2 6n o 2 m a r 2 0 1 0 大黄素的高效提取及其n m r 结构探索研究 陈东军，王磊，祖晓冬，王超磊，徐进宜。( 中国药科大学分析测试中心，江苏南京2 1 0 0 0 9 ) 摘要：目的通过n m r 定性研究大黄素的结构以及大黄素结构中的活泼， 生部位。为大黄素的化学结构修饰提供依据。 方法从虎杖中高效提取了蒽醌类化合物大黄素，采用l d 和2 d - n m

2、r 的分析方法对大黄素结构进行鉴定，通过n m r 变 温技术及n o e s y 技术研究活泼性部位。结果以d m s o 为溶荆、t m s 作内标，采用1 h n m r ，1 3 c n m r ，d e p i ，1 h hc o s y ， n o e s y ，r t s q c ，h m b c 等多种核磁共振方法对大黄素氢谱、碳谱进行完整归属，并通过n m r 变温技术及n o e s y 的研究确 定了其结构的活泼性部位。结论大黄素的3 位羟基为其活泼性部位，该信息为大黄素的结构修饰以及衍生物的设计 与抗肿瘤活性研究提供了物质基础。 关键词：大黄素；提取；n m r ；结构

3、测定 中图号：r 2 8 4 2文献标识码：a文章编号：1 0 0 0 5 0 0 5 ( 2 0 1 0 ) 0 2 一0 1 2 6 0 4 s t u d i e sf i l lf i l ee x x o n 磅e m o d i na n dl h ea n a l y g l s 磺s t r u c t u r eb yn m r c h e n d o n g j u ，w a n g l e i ，z u x i a o d o n g ，w a n g c h a o l e i ，x u j i n 一剪 ( c h i n ap h a r m a c e u t i

4、 c a lu n i t e r s i t y ，t c a , 萌i 增，2 1 0 0 0 9 ，c h n a ) a b 团认c r ：o b j - e c r i v ei no r d e rt od e v e l o pl l o v e la n t i t u n l o ra g e n t sb ym o d i f yt h es t r u c t u r eo fe n k ) d i r l s t u d i e so ht h ee x t r a c t i o n o fe m o d i na n dt h ea n a l y s i so f

5、s t r u c t u r eb yn m rw e r ec o n d u c t e d t h o d，n l ep r o c e s so fe x t r a c t i n ge m e d i nf r o mp o l y o n u r nc u p i d a t u r ns i e b e tz u c cw a so p t i m i z e da n df i o n 虻c h 鹕e sh a v eb e e nd e v e l o p e dw i t hi m p r o v e do v e r a l ly i e l d r h es t r

6、 u c t u r eo fe m e d i nw a s8 1 1 a 1 y z e db ym 慨l da n d2 ds p e c t r a b yc l a n 面喂t e m p e r a t u r et e c h n i q u ea n dn o s e yt e c h n i q u ei nn m r ，t h ea c t i v es i t eo fe m e d i ns t r u c t u r ew a si n v e s t i g a t e d r e s u l l r n l ep r o t o na n d1 3 c a b i

7、 ns p e c t r ao fe m o d i nw e r ea s s i g n e dc o m p l e t e l yb ylh n m r 1 3 c n m r ，d e p t 。 c o s y h s q c ，h m b ea n dn o e s ym e t h o d s 1 1 l ea c t i v es i t eo fe m o d i ns t r u c t u r ew a sv e r i f i e db ye h a 嘶n gt e m p e r a t u r et e c h n i q u ea n d n o s e yt

8、 e c h n i q u ei nn m r t h e ns t r u c t u r em o d i f i c a t i o n sw e r ep e r f o r m e d c o n c i j i s i o n 3 - h y c l r o x yo fe m o d i ni st h ea c t i v es i t eo f s t m e t u r ea n dt h i si n f o r m a t i o nw i l ls u p p l yam m e f i a lb a s i sf o ra n t i t u n l o ra c

9、 吐i v i t vn 砌r e ho fe m o d md e r i v a t i v e s 强w o 砌】s ：e m o d i n ；e x t r a c t ；n m r ；s t r u c t u r ea n a l y s i s 大黄素( e m o d i n ) ( 化学名为1 ，3 ，8 一三羟基一 6 一甲基蒽醌) 是从蓼科植物虎杖( p o l y o n u mc u s p i d a t u ms i e b e tz u c c ) 中提取的一种葸醌类化合 物1 ，具有免疫调节、抗菌、抗炎和抗肿瘤等多方 面的药理作用2 。主要提取方法有溶剂法、

10、水蒸 气蒸馏法和超临界萃取法等，其中溶剂提取法比 较常用 3 j 3 。文献报道的大黄素的分析方法大多采 用定量分析法 4 - 5 j ，有关大黄素结构的定性分析 尚未见报道。本文采用浸渍、加热回流及柱层析 法从虎杖中高效提取和纯化获得了大黄素，采用 1 d 和2 dn m r 分析方法对大黄素氢谱、碳谱进行 完整归属。通过n m r 变温技术及n o e s y 的研究 确定3 一位羟基为活泼性部位，为大黄素的化学 结构修饰提供依据。 l 实验部分 1 1 仪器与材料 虎杖( p o l y o n u mc u s p i d a t u ms i e b e lz u c c ) 购于

11、南京中西医结合医院；柱层析采用1 0 0 2 0 0 、2 0 0 3 0 0 目硅胶( 青岛海洋化工厂生产) ；乙醇、硫 酸、环己烷、丙酮、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯等 试剂均为市售化学纯或分析纯产品。a v 一5 0 0 型 核磁共振仪( 瑞士b r u k e r 公司) ；s h i m a d z ug c i m s q p 2 0 1 0 气质联用仪。 1 2 提取与纯化 从虎杖中提取高纯度大黄素的方法：取虎 杖饮片5 0 0g ，加入9 5 乙醇40 0 0m l 浸泡4h ，加 收稿日期：2 0 0 9 1 l 1 3 ；修稿日期 - 2 0 0 9 1 2 0 7 基金项目

12、：国家自然科学基金( 3 0 9 7 3 6 1 0 ) 作者简介：陈东军0 9 6 4 一) 。男，湖北天门市人，中国药科大学高级工程师。* 通信作者：0 2 5 8 3 2 7 1 4 4 5 。 万方数据 隆丕至：笠；太重塞煎匿夔握壑区基塑哩箜塑拯室堑窒筮2 塑 热回流4h ，过滤除去药渣，滤液浓缩至5 0m l ，回 收大部分乙醇，回流2 次合并浓缩液；浓缩液加 水l5 0 0m l 稀释，再加入5 0 硫酸3 0m l ，调节 p h 至2 ，将该溶液加热进行水解反应1h ，待红色 絮状物出现，继续加热至不再有明显絮状物生成， 停止反应。过滤，除去滤液得水解产物；水解产 物加水5 0

13、m l 搅匀，离心除去上清液，经过反复3 次水洗后即得大黄素粗品。 称取硅胶1 2 0g 溶于丙酮装柱，将大黄素粗 品与硅胶按1 ：l 的比例混合制砂，加入少量丙酮 研磨，使大黄素粗品与硅胶混合均匀，装入层析 柱，以环己烷丙酮混合溶剂( 环己烷：丙酮为5 ： 1 ) 进行洗脱，洗脱过程中用薄层板点样跟踪。当 含有大黄素的洗脱液从层析柱中流出时开始收 集，直至洗脱液中不含有大黄素时停止收集，将收 集的洗脱液蒸馏、干燥获得粗品。以9 5 乙醇重 结晶，于3 c c 静置8 1 0h 时，析晶，过滤，得黄色 针状结晶物，高效液相色谱测试提取得到的大黄 素纯度高于9 9 0 。 1 3n m r 实验

14、方法 取结晶产物0 7n a g 左右溶解于氘代二甲基 亚砜0 5m l 中，将溶液置人直径5m m 标准样品 管中，采用b r u k e r 标准脉冲程序，常规条件下测得 氢谱、碳谱、d e p t 谱、c o s y 谱、r t s q c 谱和h m b c 谱。 选择性h m b c 测定条件为：氢谱谱宽设定为 仅包含4 个不饱和质子的区域，碳谱谱宽设定为 不饱和碳区域，采样次数3 2 * 1 2 8 ，傅里叶变换矩 阵为1 0 2 4 * 5 1 2 。 n o e s y 测定条件为：1 d n o e s y 选择照射甲基 质子，采样次数6 4 次，脉冲程序采用s e l g

15、r - n o e s y ；2 d n o e s y 采样次数8 * 2 5 6 ，脉冲间隔时 间3s ，n o e s y 混合时间设为0 8s ，脉冲程序采用 g s n o e s y ，傅里叶变换矩阵为1 k * 1 k 。 n m r 变温技术：探头温度控制在2 9 3 k 的条 件下，测得氢谱，然后逐步升温，温度每升高1 0 k 稳定1 0r n i n 后，再次测定氢谱。温度最终升高到 3 6 3k ，测得系列氢谱。 2 一维和二维n m r 谱的数据分析 2 11 h n m r 、c o s y 及n o e s y 分析 1 h n m r 谱中，娩5 l 为d m s

16、 o 的溶剂峰，8 3 3 l 为水峰，饱和区除这2 个峰外，犯3 9 的一个 单峰其积分值为3 ，代表结构中的甲基质子，归属 - - 1 2 7 - - 为6 c 飓。不饱和区有4 组峰，分别代表结构中a 环和c 环未被取代的4 个不饱和次甲基质子，由 于这4 组峰化学位移比较接近，直接通过氢谱不 能确定未被取代的4 个不饱和次甲基质子对应的 化学位移。低场区还有2 个单峰和一个宽峰，代 表3 个羟基质子，直接通过氢谱对其化学位移也 不能明确归属。 h - h c o s y 谱中只有2 组较弱的相关峰，即 酾5 6 与折0 8 彼此相关，胛1 2 与泖4 4 彼此相 关，从偶合峰的强度可以

17、看出这2 组相关峰比较 弱，可以判断这2 组峰并非由直接相关所产生，而 是由远程偶合所形成。h h c o s y 给出的信息只 能将4 组峰区分为彼此相关的2 组，h h c o s y 仍 然不能确定4 个不饱和次甲基质子对应的化学位 移。因此，进一步测定大黄素的n o e s y 谱，通过 测定这些质子的空间位置关系，来确定相应的化 学位移。 插页图1 为n o e s y 局部放大图，其中图1 a 中，6 2 3 9 的甲基与胡1 2 与胡4 4 相关，相关峰 的强度几乎相同，插页图2 所示的1 d n o e 差谱 中，通过照射6 2 3 9 的甲基，定量测试出田1 2 与 舯4 4

18、 的n o e 效应分别为5 3 0 和5 6 4 ，由此 判断新1 2 与87 4 4 位于6 2 3 9 的两侧，且与8 2 3 9 的甲基在空间上相隔的距离非常接近。图 l b 中8 1 1 9 7 与胡1 2 相关，表明艿1 1 9 7 的羟基与 韶1 2 在空间上比较靠近。n o e s y 分析表明娩 3 9 、新1 2 、胡4 4 与6 1 1 9 7 为c 环的质子。从空 间位置关系可知：6 1 1 9 7 为8 位羟基氢，胡1 2 为 7 位质子，胡4 4 为5 位质子。 图1 b 中，黼5 6 、胛0 8 与8 1 1 3 3 相关，且相 关峰的强度相差不多，表明艿1 1

19、3 3 与澌5 6 及 胡0 8 在空间上比较靠近，由此判断新1 2 与8 7 4 4 位于8 1 1 3 3 的两侧，且与8 1 1 3 3 的羟基在空 间上相隔的距离比较接近。图1 b 中，8 1 2 0 4 与 8 6 5 6 相关，表明这2 组质子在空间上彼此靠近。 根据n o e s y 空间位置关系，可以确定6 1 2 0 4 为1 位的羟基氢，8 1 1 3 3 为3 位的羟基氢，胛0 8 为4 位的不饱和次甲基质子，澌5 6 为2 位的不饱和次 甲基质子。 2 21 3 c n m r 、d e p t 、a s q c 及h m b c 分析 ”c n m r 谱中，b 3

20、9 7 为d m s o 的溶剂峰， d e f t 表明没有亚甲基，有1 个甲基和4 个次甲 基。i - l s q c 中，b 2 1 6 3 与跎3 9 的甲基质子直接相 万方数据 - 1 2 8 _ 关，因此确定为与6 位碳相连的甲基碳。其余4 个不饱和次甲基碳依据i - i s q c 谱可以明确归属。 i - i m b c 中，l 位和8 位的羟基分别与8 1 6 4 5 8 、 8 1 6 1 5 4 的季碳有较强的远程偶合峰，因此艿 1 6 4 5 8 归属为c l ，8 1 6 1 5 4 归属为c 8 ，8 2 3 9 的甲 基与8 1 4 8 3 3 的季碳有很强的远程

21、偶合峰，故 8 1 4 8 3 3 归属为c 6 。8 1 0 9 0 4 的季碳与5 位和7 位 的质子有较强的远程偶合峰，依据取代苯环中处 于间位的质子偶合较强的特征，8 1 0 9 0 4 归属为 c 8 。，同理8 1 1 3 4 3 的季碳归属为c 9 a 。常规h m b c 中，8 1 6 5 7 0 的季碳与2 位和4 位的质子有较弱的 远程偶合峰，属于邻位的远程偶合，8 1 6 5 7 0 可归 属为c 3 ，而4 a 和1 0 a 位的2 个季碳没有检测到远 程偶合峰，这2 个季碳不能明确归属。选择性 h m b c 中，8 1 3 5 1 7 的季碳与4 位的质子有远程偶

22、 合峰，因此8 1 3 5 1 7 归属为瓯，8 1 3 2 8 8 的季碳则 直塞史医蕴盔堂堂拯垫! q 生三旦筮堑鲞笙2 翅 归属为c 8 。9 位和l o 位的2 个羰基碳依据h m b c 容易确定。 2 3 1 h n m r 和1 3 c n m r 谱的归属 综合以上分析，大黄素的1 h 和1 3 c 谱的归属 见表1 和表2 。 3 n m r 变温技术研究活性部位 表3 列出了大黄素的3 个羟基氢在不同温度 下的化学位移，从表中的数据可以看出，随着温度 的不断上升这3 个羟基的化学位移值逐步减小， 但是他们化学位移值减少的幅度并不相同。其中 l 一位和8 一位的羟基下降的幅度

23、较小，从2 9 3k 到3 6 3k 累计下降0 0 6p p m ，而3 一位的羟基下降 的幅度较大，从2 9 3k 到3 6 3k 累计下降0 4 1 p p m 。我们推测l 一位和8 一位的羟基与9 一位的 羰基形成分子内氢键，结构十分稳定，而3 一位的 羟基具有很强的活泼性。 襄1 大黄素的氢谱测定结果 表2 大黄素的碳谱测定结果 化学鳓卿 化墨主毵子搿嚣 归属 2 1 6 32 3 97 1 2 7 4 4 6 一c j - 1 3 1 0 8 0 36 5 6 7 馏，1 2 0 4g 1 0 8 9 07 0 86 5 6q 1 0 9 0 4 7 0 8 ，6 5 6 1 1

24、 3 4 3 7 1 2 ，7 4 4 ，1 1 9 r 7c 9 丑 1 1 2 1 ) 5 67 4 4 2 3 9 ，7 1 2g 1 2 4 2 17 1 2 2 3 9 。7 4 4 。1 1 9 r 7 c 7 1 3 2 8 8一一 c 1 0 1 3 5 1 7 7憾c“ 1 4 8 3 3 2 3 9 ，7 1 2 ，1 1 9 r 7 c 6 1 6 1 5 4 7 1 2 ，1 1 卵 q 1 6 4 5 8 6 5 6 ，1 2 0 4c i 1 6 5 7 0 6 5 6 ，7 0 8q 1 8 1 3 9 7 0 8 ，7 4 4c l o 1 8 9 7 9 6

25、5 6 ，7 0 8q 万方数据 隧丕至：笠；盘董苤盟直塑握壁垦基坚堡缝翅送窒盟童箜呈塑 表3 2 9 3k 1 0 h1 2 0 4 3 o h1 1 3 8 8 0 h1 1 9 6 大黄素的3 个羟基在不同温度下的氢谱化学位移 3 0 3k3 1 3k3 2 3k3 3 3k3 4 3k3 5 3k3 6 3k 1 2 0 41 2 0 31 2 0 31 2 0 21 2 o l1 1 9 91 1 9 8 1 1 3 31 1 2 71 1 2 31 1 2 01 1 1 71 1 0 51 0 9 7 1 1 9 r 71 1 9 61 1 9 51 1 9 51 1 9 41 1

26、 9 21 1 9 0 插页图3 为大黄素的3 个羟基氢在不同温 度下的氢谱，从谱图中可以看出，随着温度的不断 增加，1 一位和8 一位的羟基的化学位移和谱峰的 形状没有明显的变化，但是3 一位羟基峰却逐步 向高场漂移，并且谱峰也不断展宽。比较3 个羟 基的谱峰形状可知，l 一位和8 一位的羟基谱峰尖 锐，也表明这2 个羟基氢在溶液中相对固定，随整 个分子一起运动。而3 一位的羟基谱峰较宽，且 随着温度的增加不断展宽，因此该羟基在溶液中 极为活泼。 大黄素的理化性质表明，几乎不溶于水，图 1 a 所示的n o e s y 谱中，澌5 6 、胛0 8 与潞3 l 相 关，且相关峰的强度没有明显差

27、别，这说明2 位和 4 位的质子与水分子的质子在空间上比较靠近， 这表明大黄素尽管不溶于水，但在分子中存在一 定量的吸附水或者是结晶水。根据n o e s y 给出 的空间位置关系，吸附水或者是结晶水显然结合 在3 一位的羟基。n - m r 的研究结果表明，大黄素 的结构中3 一位羟基氢是极具活性的。 4 讨论 大黄素作为羟基蒽醌类化合物，分子结构的 一侧有亲脂性的甲基，而另一侧连接亲水性的羟 基，另外在1 一位和8 一位上有二个酚羟基为亲水 性基团，但这两个羟基与9 一位羰基形成稳定的 分子内氢键而使其亲水性减弱。这种特殊的结构 特征使其有别于一些脂环类或芳香类极性小的化 合物，在氯仿、乙

28、醚等亲脂性溶剂中其溶解性较 差；也有别于糖苷、氨基酸等多羟基化合物，大黄 素在水中的溶解性也很差。 在采用n m r 变温技术动态研究大黄素活性 部位过程中，温度从2 9 3k 升温至3 6 3k 时，1 一位 - - 1 2 9 - - 和8 一位的羟基虽然下降的幅度较小，但随着温 度的不断升高，其峰形已逐渐展宽，特别是当温度 升高到2 4 3k 以上时，谱峰展宽现象开始变得明 显。说明l 一位和8 一位的羟基与9 一位的羰基所 形成的分子内氢键随着温度的不断升高，其稳定 性呈减弱趋势，当温度达到一定的高度后，分子内 氢键遭到破坏，1 一位和8 一位的羟基也成为活泼 性部位。 在课题组进一步

29、的研究中，我们将在其活泼 性部位引入水溶性取代基团，以增强化合物的水 溶性和溶解性，并期望通过结构修饰改变其极性， 增强化合物的脂溶性，探索研究其抗肿瘤活性及 其作用机制。 综上，我们通过n m r 定性研究大黄素的结构 以及大黄素结构中的活泼性部位，为其抗肿瘤活 性研究提供了物质基础。在此基础上，进一步研 究将分别在l 一位、3 一位和8 一位上引入各种取 代基团，通过对多羟基蒽醌的结构修饰及其衍生 物的合成和生物活性研究，寻找探索活性高，毒副 作用小的取代蒽醌类候选新药。 参考文献： 1 刘树兴，程丽英，杨大庆虎杖中白黎芦醇与大黄素的 综合提取 j 天然药物研究与开发，2 0 0 5 ，1

30、 7 ( 5 ) ：6 3 2 2 李淑娟，沈丽霞，李伟，等大黄索药理作用研究进展 j 张家门医学院学报，2 0 0 3 ，2 0 ( 2 ) ：8 0 3 魏风玲，齐敏超，钟家胜大黄蒽醌类成分提取工艺优 选 j 中国中药杂志，1 9 9 8 ，2 3 ( 1 0 ) ：6 0 9 4 李建忠，朱文学r p - h p i e 法测定虎杖中大黄素的含 量 j 甘肃科技，2 0 0 3 ，1 9 ( 1 2 ) ：1 1 6 5 倪网东，满瑞林，李志明，等紫外分光光度法同时测 定虎杖中芪类和蒽醌类化合物 j 化学工程师，2 0 0 6 ，1 2 5 ( 2 ) ：3 5 。 ( 编辑：李伟东)

31、万方数据 图3 归芎药对2 1 个样品对小鼠离体子宫收缩幅度的影响 大黄素的高效提取及其n m r 结构探索研究 ( 正文见1 2 7 、1 2 9 页) 图1 大黄素的n o e s y 谱 图2 大黄素的i d - n o e s y 谱 i 万方数据 i v 图3 大黄素的3 个羟基在不同温度下的氢谱 江苏不同产地半夏遗传多样性的i s s r 分析 ( 正文见1 3 1 页) 图1 引物8 2 6 扩增结果 图2 不同产地半夏聚类树系图 万方数据 大黄素的高效提取及其nmr结构探索研究大黄素的高效提取及其nmr结构探索研究 作者：陈东军， 王磊， 祖晓冬， 王超磊， 徐进宜 作者单位：中国药科大学分析测试中心,江苏,南京,210009 刊名： 南京中医药大学学报 英文刊名：journal of nanjing university of traditional chinese medicine 年，卷(期)：2010,26(2) 被引用次数：2次 参考文献(5条)参考文献(5