肿瘤细胞培养方法和培养基

1、肝癌细胞培养一、徽章1、RPMI-1640 10%胎儿牛血清培养基2、DMEM 15%胎儿牛血清培养基成分表二、实验前的准备：工人的皮肤，培养瓶盖，外壁经常用酒精消毒。实验室空气、工作台和其他方法不能消毒的部分培养基。进入无菌室之前或实验结束后，打开灯消毒30分钟。如果紫外线照射60分钟，大部分细菌就会在空气中被清除。1、玻璃制品清洗和杀菌(5%盐酸溶液，重铬酸钾120毫升，硫酸200毫升，蒸馏水200毫升):(1) :新使用或重复使用的玻璃器具要用5%盐酸溶液或自来水浸泡一夜，或煮30分钟冲洗。去除新购买的玻璃器皿中的灰尘、铅、砷等，也去除了其弱碱性物质。(2)浸泡：后，用柔软的刷子和优质的

2、洗面奶擦拭。擦后逐行烘干。(3)酸浸：刷洗的玻璃制品，应在酸浸前适当烘干或烘干，使酸提取物稀释，以免影响效果。把玻璃制品完全浸入清洗液中。清洗液酸性很强，操作过程中要戴保护套。(4)煤油：胆酸玻璃器皿首先用自来水充分冲洗，吸管10分钟，碗各装满自来水，重复10次以上，用蒸馏水冲洗2-3次，不留下酸性残渣，将清洗过的玻璃器皿放入烘干机，干燥的玻璃器皿干净透明，没有烟尘，有害物质或化学(5)包装灭菌：基材清洗干燥或干燥后，首先要严格包装，进行消毒灭菌处理，杀菌后防止再次污染。包装材料经常使用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉、铝便当、玻璃或金属吸管、纸绳等。2、清洁和消毒橡胶制品：0.5mol/L NaO

3、H煮沸15分钟，在流动的水中冲洗0.5mol/L HCl，在流动的水中冲洗15分钟，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50 在干涸的水中煮沸3、塑料制品清洗和消毒(帽、离心管):使用器具后，立即用水冲洗，整夜浸泡在自来水中，用纱布、棉棒和50 的清洁剂擦拭，在流动的水中冲洗，晾干，在清洁液中浸泡15分钟，冲洗(15-20次)，将蒸馏水浸泡3次，在24小时内烘干两次蒸的水泡，晾干草料。三、细胞恢复：冷冻保存细胞保存管被保存在液氮中(-196)，去除保存管后，要迅速冷冻，使冰晶重新结晶，避免对细胞造成伤害，使细胞死亡。冷冻储存细胞的保存管中含有对细胞有毒的成分DMSO，解冻时应立即去除。冷冻激活

4、前，在灭菌台上正确对准细胞培养液后，要从液氮中取出保存管，放入37 的温水中，快速解冻细胞。解冻后，悬浮液迅速被培养液吸收，离心去除上等液，然后加入细胞培养液。实验者们戴上灭菌实验室，将酒精洒在手上消毒，然后用酒精棉棒在原地擦拭实验台(1)15毫升离心机滴管5-9毫升培养液(8毫升)。(2)从液氮瓶中取出冷冻保管管，快速放入37 的水浴，随时摇动，使其快速融化，在30 60s内完成。(3)冷冻保管管酒精70%擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬浮液转移到上述离心管(用培养基再次冲洗冷冻管，去除附着在墙上的所有细胞)。(4)拆卸低速离心(1000r/min) 5min后，用8ml培养液再次清洁离

5、心力。(5)离心后，滴上清液，将3ml培养液(RPMI-1640)放入离心管中，搅拌均匀(可以用滴管轻吹)。(6)将离心管的混合液转移到培养瓶后，在培养瓶上滴下15滴小牛的血清，盖上瓶盖，标记细胞种类、日期、培养人的名字等，然后将培养瓶扁平地展开，放入37C培养箱中进行培养。2-3天换一次徽章。四、细胞系：如果观察培养瓶里的细胞扩散到90%(细胞在代数期间生长)，就要解冻成功复活的细胞，分离培养。否则，细胞可能缺乏生存空间或密度过高，有营养障碍，影响细胞生长。细胞原来在培养瓶内分离稀释后在新的培养瓶中培养的过程称为继代培养。多代细胞主义最大的意大利为便于实验，提供了很多持续的实验物质。(1)准

6、备试验台的消毒工作，废弃旧培养液，用PBS溶液(钙、镁离子除外)冲洗1-2次，防止剩余培养液影响胰蛋白酶活性。(细胞附着生长)。(2)在瓶子里放入1毫升消化液(0.25%Trypsin-0.53mEDTA)，在37孵化箱或室温(25 温度)下消化，1-3min后将培养瓶倒放在显微镜下观察，发现细胞质收缩，细胞间距增大，应立即停止消化注：如果细胞没有脱壁，生长良好，直接倒入消化液，加入培养液8毫升，用离心力收集细胞；很多细胞被确认为脱壁状态(即过度分离)后，添加培养液，用离心力收集细胞。(4)倒入消化液，在瓶子里使用滴管，放少量培养液(约2毫升)，轻轻转动培养瓶，冲洗剩余胰腺蛋白质液消化液，加入

7、3ml培养液15滴小牛血清。(5)利用吸管拉出瓶内培养液，依次反复轻吹瓶壁细胞，从瓶壁上脱落，形成细胞悬浮液。吹的时候要用力，以防止细胞过度损伤。(6)将准备好的细胞悬浮液放入离心管，离心(1000r/min) 5min。(7)离心后，在离心管中倒入液体，在离心管中加入3ml培养液，反复吹出细胞，形成细胞悬浮液。(8)取3个无菌培养瓶，擦拭酒精棉棒消毒，在酒精灯下过度消毒。(9)培养瓶中分别加入1ml细胞悬浮，2ml培养液(使用吸管)，15滴小牛血清，在酒精灯下过量填充。(10)细胞培养交换时间取决于细胞生长的状态和实验要求。通常在2 3d后需要更换一次生长液。细胞装满碗的底部后，就可以使用了

8、。也可以继续扩大培养或将培养换成维持液的过程。五、细胞冷冻保存：细胞的冷冻保存最常用液氮冻结保存法，主要是加入适量的保护剂，慢慢冷冻的细胞。因为细胞不添加保护剂，细胞内外的水分很快就会形成冰晶，引起一系列副作用。由于细胞脱水，局部电解质浓度升高，PH值发生变化，部分蛋白质因变性而扰乱细胞内部结构，导致溶酶体被破坏，释放大量酶，破坏细胞内部结构。因此，细胞结冰时最重要的是尽量减少细胞内水分，最小化细胞内冰晶的形成。因此，冷冻保管时使用甘油或DMSO作为保护剂，分子量小、溶解度高，容易渗透细胞，降低冰点，提高水对细胞膜的通透性，对细胞毒性小，倾斜缓慢的冻结可以减少细胞内水分渗入细胞外形成冰晶的细胞

9、损伤。细胞低温保存是培养室的日常工作和一般技术。细胞冻存-196液氮中储存时间几乎是无限的。细胞冷冻保存和复苏的原则是缓慢冻结和快速融化。(1)选择代数增殖期细胞(细胞覆盖90%左右时)，冷冻前1d交换。(2)准备试验台的消毒工作，倒入培养瓶内的旧培养液。(3)为了复盖培养瓶底部，最好将1ml 0.25%胰蛋白酶溶液放入瓶内。(4)在37 的孵化箱或室温(25 的温度)下，为消化放置1-3min后，用显微镜反向观察培养瓶，细胞质量收缩，细胞间距变大，应立即停止消化。(5)吸出消化液，去除胰蛋白酶液，直接放入3ml培养液15滴小牛血清，结束消化。(6)使用弯头吸管拉出瓶内培养液，依次反复轻吹瓶壁细胞，从瓶壁上脱落，形成细胞悬浮液。翅膀软化，防止细胞过度损伤，照常用悬浮液制造培养细胞。(7)从培养瓶将细胞悬浮输送到15ml离心管，(1200r/min) 6min，去除上清液。添加3ml培养液，以现有方法形成细胞悬浮液。(8)准备冷冻保存培养液(培养液7毫升，10%犊牛血清2毫升，10% DMSO 1毫升)，将1毫升细胞悬浮液放入离心管，加入适量冷冻保存培养液，用吸管轻轻拍打，均匀细胞。(9)将细胞悬浮液分别装扮在灭菌冷冻管上1.5毫升(冷冻液先