3T3-L1细胞诱导分化

1、首先，细胞的数量必须足够。接触抑制后，加入诱导液。诱导液1(IBMX为SIGMA，浓度为0.5m mol/l，混合时用DMSO浓度为1000倍，DEX为100毫克，用Solarbio单独包装，用DMSO溶解，Ins为我用的人胰岛素，医院购买)。最重要的是细胞的产生是在20代以内。更换诱导液时，缓慢加入200微升而不是1微升移液管。待细胞充分生长后，进行2天的接触抑制(即细胞退出生长周期)，加入含IBMX(一般使用浓度为0.5毫摩尔/升)、DEX(地塞米松，一般使用浓度为1毫摩尔/升)和胰岛素(胰岛素，一般使用浓度为1-10微克/毫升)的培养基2天，然后仅更换含胰岛素的培养基2天，然后每2天更换

2、一次液体(一般培养基)。这是分化的步骤，但最重要的是细胞传代的数量。我现在正在做诱导。细胞传代次数多，分化率低。一般来说，不应超过20代，最好在10代以内。在诱导分化中，细胞的世代数和状态是最重要的。诱导剂的制备IBMX(异丁基-甲基-黄嘌呤):分子量：222.2(西格玛：I5879)-20度保存用二甲基亚砜制备111.1毫克/毫升(0.5毫升/升)的储存溶液最终浓度为0.5毫摩尔/升，即每100毫升培养液中加入100微升储存液。分子量：392.5(西格玛3360D4902)-20度保存用无水乙醇制备1毫克/毫升(2.5毫升/升)的储存溶液最终浓度为1微升/升，即每100毫升培养液中加入40微

3、升储存液。有效期为2年。胰岛素：分子量：6000，4度保存储备溶液为诺和灵R: 400国际单位/10毫升最终浓度为10微克/毫升，即每100毫升培养液中加入600微升原液。4度保存3T3-L1前脂肪细胞株的诱导和分化1)将3T3-L1前脂肪细胞接种在培养板上，用含10%小牛血清的高糖DMEM培养液在37和5% CO2下培养；2)在细胞生长至80-90%并融合2天后(融合是指允许细胞接触并抑制，即细胞在完全生长后再生长2天)，加入含有0.5毫升/升IBMX(储存液浓度0.5毫升/升)、1毫升/升(储存液浓度1毫克/毫升(2.5毫升/升)DEX和10微克/毫升胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM并培

4、养48小时；小时；(在使用时，将诱导剂加入培养液中，以便均匀混合)3)48h后，将最终浓度为10ug/ml的含胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养液更换48h，48h后，更换10%小牛血清高糖DMEM进行进一步培养。2天后，更换一次培养液，诱导分化8-12天的90%以上的3T3-L1细胞显示成熟的脂肪细胞表型，可用于实验。感应操作的注意事项：1.总共需要诱导3次。每次诱导的时间点优选是固定的，以确保诱导物工作48小时。如果导致时间冲突，诱导时间只能延长，不能短于48小时。2.注意诱导操作：以6孔板为例，每孔3毫升培养液，每6孔板18毫升培养液，第一次诱导的诱导剂剂量为：IBMX18ul(储存

5、液)、DEX7.2ul储存液、胰岛素108ul(储存液)。第一次诱导时，用200微升移液枪向每个孔中加入200微升制备好的诱导液，沿孔壁边缘缓慢注入培养液。动作必须缓慢，否则细胞会上浮，通常称为卷曲。每孔加入200微升培养液5次，共1微升，每孔第二次和第三次加入1000微升培养液。方法同上，操作缓慢而轻松。3.第二次诱导时，诱导剂的制备如下：加入18毫升培养液，108微升胰岛素(储存液)，混合均匀。操作步骤和以前一样。第一次和第二次感应非常重要，动作必须缓慢。第三次诱导只需更换10%高糖DMEM培养液，但操作步骤同前。如果总的结果是好的，在第三次诱导前细胞中可以看到少量的脂滴，培养物在3T3-

6、L1细胞的诱导和分化中，在最初两天的融合期间，确定您使用的是DMEM高糖小牛血清。诱导的第一阶段(MDI诱导，DMEM高糖胎牛血清)只能在细胞高度融合后开始。在第一阶段之后，可以观察到细胞已经开始变圆。在诱导的第二阶段(胰岛素诱导，DMEM高糖胎牛血清)，可以在细胞中观察到脂肪滴。当进入诱导的第三阶段时，脂肪液滴的积累更加明显。诱导剂如地塞米松需要溶解在乙醇中，IBMX溶解在一定浓度的氢氧化钾中，胰岛素溶解在一定浓度的盐酸中，并且诱导分化的程度也与细胞有关，这两种细胞都是3T3-L1细胞。然而，每个细胞的分化能力是非常不同的。当分化诱导未进入时，不得使用胎牛血清来培养细胞！少数细胞在分化过程中

7、死亡是正常的！每两天换一次液体，所以小心被污染！我祝大家实验顺利。一起学习！因为3T3-L1加入诱导剂后，收缩非常剧烈，相对脆弱，很容易上浮。因此，当添加诱导剂时，操作应该特别轻。最好用枪头而不是移液器来添加诱导器，因为很难控制流速，而且在家移液时强度很大。当向枪头添加诱导剂时，有必要粘在壁上并让液体缓慢停留，以便对细胞的影响很小。我在做诱导分化。如果一小部分感觉细胞漂浮起来，它仍然可以使用。它没有多大影响。如果范围比较大，最好再诱导一次。你的诱导剂的浓度和普通人用的不一样。IBMX通常以0.5毫摩尔/升使用，胰岛素通常为1-10微克/毫升，地塞米松通常以0.25、1、10毫摩尔/升使用。此外

8、，你不知道你买的胰岛素是水溶性的吗？因为正常的胰岛素不溶于水，但在酸性环境中可溶于水，所以在制备溶液时需要少量稀盐酸来溶解胰岛素。另外两种诱导剂对你的制备方法没有问题。显微镜下观察到的细胞接触抑制的形态是什么？关于这一点没什么好说的，就是它不饱满，互相接触，如果你的细胞出现集群现象，那么接触抑制过度，那么细胞就更有可能漂浮起来。这需要你自己把握机会，因为如果接触抑制时间不够，诱导剂将不会起作用，直到细胞退出生长周期。如果接触抑制过度，细胞很容易漂浮。你需要自己去发现分化必须在良好的细胞条件下诱导。3T3-L1增长非常快。如果它在完全生长后不改变液体，大量细胞将死亡。判断细胞好坏的标准是细胞融合

9、后的培养基中几乎没有漂浮的死细胞。因此，在接种过程中，诱导子代的细胞数量不应太多，优选在104的数量级，这样细胞可以在3天后被覆盖，然后液体被改变，细胞可以生长2-3天。此时，细胞将退出生长周期并进入生长停滞状态。2.IBMX有许多溶解方法，不同的文件有不同的方法。可以使用二甲基亚砜、乙醇、浓盐酸和氢氧化钾溶液。鉴于您提到的结晶问题，我们建议您尝试1M氢氧化钾，即0.0115吉卜赛940微升ddh H2O 60微升氢氧化钾。3.较高的胰岛素浓度只会促进分化，而不会产生抑制作用。因为前细胞细胞膜上几乎没有胰岛素受体，所以应该添加超过生理浓度的胰岛素来激活细胞膜上的胰岛素样生长因子1受体，并通过胰

10、岛素样生长因子1途径诱导分化。我用的方法是美国密歇根大学的3T3-L1细胞分化协议(非常详细)，现在分发给所有同志分享，呵呵。如果我们不能成功区分，我们只能质疑细胞问题。3T3-L1鉴别方案材料杜尔贝克斯改良鹰中型(DMEM；高葡萄糖，含L-谷氨酰胺，含盐酸吡氧啶，不含丙酮酸钠)小牛血清(GibCoBML-卡特彼勒编号16170-078/批号1060198)胎牛血清(GibCoBML-Cat # 10437-028/批号# 1026566)-在混合到DMEM之前进行过滤灭菌(0.22um过滤器)异丁基甲基黄嘌呤(IBMX西格玛I-7018)DexamMEM丙酮酸钠(100毫米；吉布伯尔卡特彼勒

11、#11360-070)笔/链球菌/谷氨酰胺(100倍p/S/G；吉布伯尔卡特彼勒#10378-016)解决方法10%小牛血清/DMEM60毫升小牛血清6毫升100毫米MEM丙酮酸钠6毫升100倍P/S/G500毫升DMEM10%胎膜早破/DMEM60毫升胎牛血清（过滤灭菌)6毫升100毫米MEM丙酮酸钠6毫升100倍P/S/G500毫升DMEMIBMX解决方案（新鲜制作)a)将IBMX溶解在由0.5牛氢氧化钾制成的溶液中，最终浓度为0.0115克/毫升。b)通过0.22毫米注射器过滤器进行过滤消毒。胰岛素原液167微米(1毫克/毫升)在0.02毫升盐酸中通过0.22毫米过滤器灭菌的过滤器长期可

12、储存在-20摄氏度，短期可储存在4摄氏度。地塞米松原液冷冻箱储存： 10毫米Dex 100%乙醇（储存在-20摄氏度)工作仓：将冷冻仓稀释至1毫米过滤消毒并储存在4C .人工数据输入诱导培养基(10毫升/10厘米板；5mL/6厘米板)至所需体积的10%胎牛血清/DMEM加：1:100 IBMX1:1000胰岛素1:1000地塞米松库存胰岛素培养基(10毫升/10厘米平板；5mL/6厘米板)至所需体积的10%胎牛血清/DMEM加：1:1000胰岛素方法前脂肪细胞的维持和传代：我们将细胞在10%加勒比海/DMEM培养基中培养在康宁公司生产的聚苯乙烯培养皿中(430167类)，并在37和10%二氧化碳中培养。重要的是每隔几天喂养前脂肪细胞，并避免让它们过于融合(70%)，如果你想继续传代并在以后分化它们。所以，注意适当地分割它们。它们可以被拆分到1:15，尽管我们通常会根据需要拆分到1:10或更少。脂肪细胞分化协议：1.在10%小牛血清/DMEM中培养前脂