设计培养基的制备的实验方案

1、设计培养基的制备的实验方案制药1302闫敏一、实验设计思想金黄色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus Rosenbach) 是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属（Staphylococcus）。有“嗜肉菌的别称。可引起许多严重感染。细菌按形态可分为：球菌，杆菌，和螺旋菌。金黄色葡萄球菌就是球菌的一种。它是革兰氏阳性菌的代表。革兰氏阳性菌就是可以被结晶紫初染，碘液媒染，乙醇脱色，沙黄（红色）复染后呈现紫红色的细菌。而革兰氏阴性菌则呈现红色。这些差别源于金黄色葡萄球菌具有阴性菌所没有的细胞壁结构。金黄色葡萄球菌细胞壁含90%的肽聚糖和10%的磷壁酸。相反，阴性菌没有细胞壁结构

2、。1葡萄球菌属（Staphylococcus）至少包括有20个种。其中金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，引起许多严重感染。典型的金黄色葡萄球菌为球形，直径0.8m左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。是一种不利于人体的细菌。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37，最适生长pH 7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10%-15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP

3、反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。在干燥环境中存活数月；空气中存在，但不繁殖。耐热性强，加热701h，8030min不被杀死；耐低温，在冷冻食品中不易死亡；耐高渗，在含有50%-66%蔗糖或15%以上食盐食品中才可被抑制，能在15%NaCl和40%胆汁中生长。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。 金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，广泛分布于自然界，可以引起人和动物的感染。在人体主要寄殖于鼻前庭黏膜、腹股沟、会阴部和新生儿脐带残端等部位，偶尔也寄生于口咽部、皮肤、肠道及阴道口等，是医院感染常见的病原体之一。在医院里，耐甲

4、氧西林和其他抗生素的金黄色葡萄球菌广泛流行，对万古霉素不敏感的菌株也有所增加，给临床治疗带来了很大的困难。金黄色葡萄球菌除了引起感染外，其产生的肠毒素可污染食物而致食物中毒，为人类带来非常严重的公共卫生负担 包括：原因、研究价值或意义等。二、实验目的（同综合实验）2.1学习培养基的制作过程和注意事项。2.2学习设计培养基和倒平板。2.3学习高压蒸汽灭菌过程和使用方法。2.4学习实验方案设计。三、实验基本流程（可画流程图）称药品溶解调pH值融化琼脂过滤分装包扎标记灭菌摆斜面或倒平板。四、实验原理4.1微生物的营养类型光能自养型的微生物可在完全无机的环境中生长，以CO2为碳源，光做能源，无机物为供

5、H体还原CO2合成细胞有机物质的微生物。可以直接利用光能把无机物转化成自身需要的糖类等有机物，比如蓝藻。化能自养型的微生物可以在完全无机的环境中生长发育，以无机化合物氧化为时释放的能量为能源，以CO2或碳盐为碳源，合成细胞物质的微生物。这类细菌包括硫细菌、硝化细菌、铁细菌等，硫细菌和硝化细菌与生产密切相关。所以我们的生活是依赖微生物的。 对于异养型微生物： 光能异养型微生物，这类微生物具有光合色素。能利用光做能源，以有机化合物为供H体，还原CO2，合成细胞物质的微生物。光能异养微生物能利用CO2，但必须在有机物存在的条件下，才能生长，人工培养还需供给生长因素。目前已用这类微生物，如红螺菌来净化

6、高浓度有机废水，这对处理污水、净化环境，很有发展前途。 化能异养型微生物，这类微生物以有机化合物为碳源，利用有机化合物氧化过程中产生的能量为能源，以有机或无机含氮化合物为氮源，合成细胞物质。由于栖息场所和摄取养料不同，可将异养微生物分为腐生型和寄生型两大类。 腐生型：利用无生命的有机物获得营养物质。 寄生型：从活的寄生体内获取营养物质，如病毒。 中间类型（兼性腐生或兼性寄生）如结核杆菌、痢疾杆菌就是兼性寄生菌 自养型微生物与异养型微生物的区别不在能否利用CO2，而 在于是否以CO2为唯一或主要碳源进行生长。自养型微生物以无机碳化物为碳源，但也可能也可以利用有机物进行生长。异养型微生物虽然也可利

7、用CO2，但必须在有机碳存在情况下。有些微生物在不同生4.2营养进入微生物的方式 扩散(diffusion) 原生质膜是一种半透性膜，营养物质通过原生质膜上的小孔，由高浓度的胞外环境向低浓度的胞内进行扩散。是非特异性的营养物质吸收方式。 特点:在扩散过程中，营养物质的分子结构不发生变化不消耗能量,不能逆浓度运输运输,速率与膜内外物质的浓度差成正比, 细胞膜的特性、膜上含水小孔的大小和形状对被扩散的营养物质分子的种类、大小有一定的选择性。物质跨膜扩散的能力和速率与物质本身的性质有关,分子量小、脂溶性、极性小的物质易通过扩散进出细胞扩散并不是微生物细胞吸收营养物质的主要方式,水是唯一可以通扩散自由

8、通过原生质膜的分子,脂肪酸、乙醇、甘油、苯、一些气体分子(O2、CO2)及某些氨基酸在一定程度上也可通过扩散进出细胞。促进扩散易化扩散是膜蛋白介导的被动扩散。物质通过膜上的特殊蛋白质（包括载体、通道）的介导、顺电化学梯度的跨膜转运过程，其转运方式主要有两种：一是经载体介导的易化扩散。二是经通道介导的易化扩散。单纯扩散与易化扩散都属于被动转运，被动转运的主要特点是：转运物质过程的本身不需要消耗能量易化扩散是膜蛋白介导的被动扩散。物质通过膜上的特殊蛋白质（包括载体、通道）的介导、顺电化学梯度的跨膜转运过程，其转运方式主要有两种：一是经载体介导的易化扩散。二是经通道介导的易化扩散。单纯扩散与易化扩散

9、都属于被动转运，被动转运的主要特点是：转运物质过程的本身不需要消耗能量，是在细胞膜上的特殊蛋白的“帮助”下，顺着浓度梯度或电位梯度进行的跨膜转运，是一个“被动”的过程。促进扩散同简单扩散相比，具有以下一些特点： 促进扩散需要膜蛋白的帮助，并且比简单扩散的速度要快几个数量级。 简单扩散的速率与溶质的浓度成正比，而膜蛋白帮助的促进扩散可以达到最大值，当溶质的跨膜浓度差达到一定程度时，促进扩散的速度不再提高。 在简单扩散中，结构上相似的分子以基本相同的速度通过膜，而在促进扩散中，运输蛋白具有高度的选择性。如运输蛋白能够帮助葡萄糖快速运输，但不帮助与葡萄糖结构类似的糖类运输。 与简单扩散不同，运输蛋白

10、的促进扩散作用也会受到各种抑制。膜运输蛋白的运输作用也会受到类似于酶的竞争性抑制，以及蛋白质变性剂的抑制作用。主动运输是指物质逆浓度梯度，在载体的协助下，在能量的作用下运进或运出细胞的过程。Na+、K+和Ca2+等离子，都不能自由地通过磷脂双分子层，它们从低浓度一侧运输到高浓度一侧，需要载体蛋白的协助，同时还需要消耗细胞内化学反应（主要为呼吸作用）所释放的能量。钠钾泵实际上就是Na+-K+ATP酶，一般认为是由2个大亚基、2个小亚基组成的4聚体。Na+-K+ATP酶通过磷酸化和去磷酸化过程发生构象的变化，导致与Na+、K+的亲和力发生变化。在膜内侧Na+与酶结合，激活ATP酶活性，使ATP分解

11、，酶被磷酸化，构象发生变化，于是与Na+结合的部位转向膜外侧；这种磷酸化的酶对Na+的亲和力低，对K+的亲和力高，因而在膜外侧释放Na+、而与K+结合。K+与磷酸化酶结合后促使酶去磷酸化，酶的构象恢复原状，于是与K+结合的部位转向膜内侧，K+与酶的亲和力降低，使K+在膜内被释放，而又与Na+结合。其总的结果是每一循环消耗一个ATP；转运出三个Na+，转进两个K+。钠钾泵的一个特性是他对离子的转运循环依赖自磷酸化过程，ATP上的一个磷酸基团转移到钠钾泵的一个天冬氨酸残基上，导致构象的变化。通过自磷酸化来转运离子的离子泵就叫做P-type，与之相类似的还有钙泵和质子泵。它们组成了功能与结构相似的一

12、个蛋白质家族。Na+-K+泵作用是：维持细胞的渗透性，保持细胞的体积；维持低Na+高K+的细胞内环境，维持细胞的静息电位，同时也是动作电位的基础。乌本苷（ouabain）、地高辛（digoxin）等强心剂能抑制心肌细胞Na+-K+泵的活性；从而降低钠钙交换器效率，使内流钙离子增多，加强心肌收缩，因而具有强心作用。钙离子泵钙离子泵对于细胞是非常重要的，因为钙离子通常与信号转到有关，钙离子浓度的变化会引起细胞内信号途径的反应，导致一系列的生理变化。通常细胞内钙离子浓度（10-7M）显著低于细胞外钙离子浓度（10-3M），主要是因为质膜和内质网膜上存在钙离子转运体系，细胞内钙离子泵有两类：其一是P型

13、离子泵，其原理与钠钾泵相似，每分解一个ATP分子，泵出2个Ca2+。另一类叫做钠钙交换器（Na+-Ca2+ exchanger），属于反向协同运输体系（antiporter），通过钠钙交换来转运钙离子。位于肌质网（sarcoplasmic reticulum）上的钙离子泵是了解最多的一类P型离子泵，占肌质网膜蛋白质的90%。肌质网是一类特化的内质网，形成网管状结构位于细胞质中，具有贮存钙离子的功能。肌细胞膜去极化后引起肌质网上的钙离子通道打开，大量钙离子进入细胞质，引起肌肉收缩之后由钙离子泵将钙离子泵回肌质网。质子泵质子泵有三类：P-type、V-type、F-type。1、P-type：载体

14、蛋白利用ATP使自身磷酸化（phosphorylation），发生构象的改变来转移质子或其它离子，如植物细胞膜上的H+泵、动物细胞的Na+ -K+泵、Ca2+离子泵，H+ -K+ATP酶（位于胃表皮细胞，分泌胃酸）。2、V-type：位于小泡（vacuole）的膜上，由许多亚基构成，水解ATP产生能量，但不发生自磷酸化，位于溶酶体膜、动物细胞的内吞体、高尔基体的囊泡膜、植物液泡膜上。3、F-type：是由许多亚基构成的管状结构，H+沿浓度梯度运动，所释放的能量与ATP合成耦联起来，所以也叫ATP合酶（ATP synthase），F是氧化磷酸化或光合磷酸化偶联因子（factor）的缩写。F型质子

15、泵位于细菌质膜，线粒体内膜和叶绿体的类囊体膜上。F型质子泵不仅可以利用质子动力势将ADP转化成ATP，也可以利用水解ATP释放的能量转移质子。ABC 转运器ABC转运器（ABC transporter）最早发现于细菌，是细菌质膜上的一种运输ATP酶（transport ATPase），属于一个庞大而多样的蛋白家族，每个成员都含有两个高度保守的ATP结合区（ATP binding cassette），故名ABC转运器，他们通过结合ATP发生二聚化，ATP水解后解聚，通过构象的改变将与之结合的底物转移至膜的另一侧。在大肠杆菌中78个基因（占全部基因的5%）编码ABC转运器蛋白，在动物中可能更多。虽

16、然每一种ABC转运器只转运一种或一类底物，但是其蛋白家族中具有能转运离子、氨基酸、核苷酸、多糖、多肽、甚至蛋白质的成员。ABC转运器还可催化脂双层的脂类在两层之间翻转，这在膜的发生和功能维护上具有重要的意义。第一个被发现的真核细胞的ABC转运器是多药抗性蛋白（multidrug resistance protein, MDR），该基因通常在肝癌患者的癌细胞中过表达，降低了化学治疗的疗效。约40%的患者的癌细胞内该基因过度表达。ABC转运器还与病原体对药物的抗性有关，如临床常用的抗真菌药物有氟康唑、酮康唑、伊曲康唑等，真菌对这些药物产生耐药性的一个重要机制是通过MDR蛋白降低了细胞内的药物浓度。

17、协同运输协同运输（cotransport）是一类靠间接提供能量完成的主动运输方式。物质跨膜运动所需要的能量来自膜两侧离子的电化学浓度梯度，而维持这种电化学势的是钠钾泵或质子泵。动物细胞中常常利用膜两侧Na+浓度梯度来驱动，植物细胞和细菌常利用H+浓度梯度来驱动。根据物质运输方向与离子沿浓度梯度的转移方向，协同运输又可分为：同向协同（symport）与反向协同（antiport）。1、同向协同同向协同（symport）指物质运输方向与离子转移方向相同。如动物小肠细胞对葡萄糖的吸收就是伴随着Na+的进入，细胞内的Na+离子又被钠钾泵泵出细胞外，细胞内始终保持较低的钠离子浓度，形成电化学梯度。在某些

18、细菌中，乳糖的吸收伴随着H+的进入，每转移一个H+吸收一个乳糖分子。2、反向协同反向协同（antiport）物质跨膜运动的方向与离子转移的方向相反，如动物细胞常通过Na+/H+反向协同运输的方式来转运H+以调节细胞内的PH值，即Na+的进入胞内伴随者H+的排出。此外质子泵可直接利用ATP运输H+来调节细胞PH值。还有一种机制是Na+驱动的Cl-HCO3-交换，即Na+与HCO3-的进入伴随着Cl-和H+的外流，如红细胞膜上的带3蛋白。功能主动运输这种物质出入细胞的方式，能够保证活细胞按照生命活动的需要，主动地选择吸收所需要的营养物质，排出新陈代谢产生的废物和对细胞有害的物质。可见，主动运输对于

19、活细胞完成各项生命活动有重要作用。维持细胞内正常的生命活动,对神经冲动的传递以及对维持细胞的渗透平衡,恒定细胞的体积都是非常重要的.主动运输（active transport):质膜上的载体蛋白将离子、营养物和代谢物等逆电化学梯度从低浓度侧向高浓度侧的耗能运输。所耗能量由具ATP酶活性的膜蛋白分解ATP提供。例如正常生理条件下，人红细胞内K+的浓度相当于血浆中的30倍，但K+仍能从血浆进入红细胞内，Na+浓度比血浆中低很多，但Na+仍由红细胞向血浆透出,呈现一种逆浓度梯度的“上坡”运输。差异有三个主要的差异：起始条件不同、运输方式不同、产生的结果不同。主动运输消耗细胞代谢释放的能量，被动运输不

20、4.3选择培养基的原则等。（一）配制培养基的4个原则1.目的明确 培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；培养目的不同，原料的选择和配比不同； 例如枯草芽孢杆菌： 一般培养：肉汤培养基或LB培养基； 自然转化：基础培养基； 观察芽孢：生孢子培养基； 产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基； 根据不同的工作目的，微生物不同的营养需要，运用自己丰富的生物化学和微生物学知识来配制最佳的培养基。 2.营养协调 微生物细胞组成元素的调查或分析，是设计培养基时的重要参考依据。 微生物细胞内各种成分间有一较稳定的比例。 在大多数化能异养菌的培养基中，各营养要素间在量上的比例大体符合以下十倍序列的递减规

21、律： 要素：H2OC源+能源 N 源 P、SK、Mg生长因子 含量：(10-1) (10-2) (10-3) (10-4) (10-5) (10-6)A.选择适宜的营养物质,实验室的常用培养基： 细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）； 放线菌：高氏1号合成培养基培养； 酵母菌：麦芽汁培养基； 霉菌：查氏合成培养基； 实验室一般培养：普通常用培养基； 遗传研究：成分清楚的合成培养基； 生理、代谢研究：选用相应的培养基配方； B.营养物质浓度及配比合适 营养物质的浓度适宜, 营养物质之间的配比适宜； 高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，反而起 到抑制或杀

22、菌作用。培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和（或）代谢产物的形成和积累，其中碳氮比（CN）的影响较大。真菌需CN比较高的培养基；（素食） 细菌（动物病原菌）需CN比较低的培养基；（荤食） 发酵生产谷氨酸时： 碳氮比为4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少； 碳氮比为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸产量则大量增加。 NH3 CO(NH2)2 NH4NO3 (NH4)2CO3 (NH4)2SO4 含氮量（82）（46） （35） （29.2） （21） 这说明在同样重量时，在以上各氮源中含氮量以氨为最高，尿素次之，硝酸铵和碳酸铵更次之，而硫酸铵则最低。 3.理化适宜 指培养

23、基的pH值、渗透压、水活度和氧化还原电势等物理化学条件较为适宜。 包括：pH、渗透压和水活度、氧化还原电位(1) pH 各大类微生物都有其生长适宜的pH范围，培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。 通常培养条件：（初始pH ） 细菌： pH 7.0-8.0 藻类： pH 6.0-7.0 酵母菌： pH 3.8-6.0 放线菌：pH 7.5-8.5 霉菌：pH 4.0-5.8 原生动物： pH 6.0-8.0 嗜极菌（extremophiles） 在微生物的生长、代谢过程中会产生引起培养基pH改变的代谢产物，为了维持培养基 pH的相对恒定，通常要进行p

24、H的调节。 pH的调节包括pH的内源调节和pH的外源调节。 a.pH的内源调节:通过培养基内在成分所起的调节作用，就是pH的内源调节。 第一种是采用磷酸缓冲液进行调节。 K2HPO4/KH2PO41时，溶液的pH稳定在6.8。调节K2HPO4和KH2PO4两者浓度比可获得pH 6.07.6间的一系列稳定的pH。 反应原理：K2HPO4HClKH2PO4KCl KH2PO4KOHK2HPO4H2O 第二种以CaCO3作“备用碱”进行调节。CaCO3（不溶于水又是沉淀性的，在培养基中分布不均匀）、NaHCO3均可用来调节培养基的pH。 反应是：b.pH的外源调节: 这是一类按实际需要不断从外界流加

25、酸或碱液，以调整培养液的方法。(2) 渗透压和水活度 渗透压（osmotic pressure）是某水溶液中一个可用压力来量度的一个物化指标。 它表示两种浓度不同的溶液间被一个半透性薄膜隔开时，稀溶液中的水分子会因水势（water potentiality）的推动而透过隔膜流向浓溶液，直到浓溶液产生的机械压力足以使两边水分子的进出达到平衡为止，这时由浓溶液中的溶质所产生的机械压力，即为它的渗透压值。 与微生物细胞渗透压相等的等渗溶液最适宜微生物的生长； 高渗溶液会使细胞发生质壁分离； 低渗溶液则会使细胞吸水膨胀，形成很高的膨压，这对细胞壁脆弱或丧失的各种缺壁细胞，例如原生质体、球状体或支原体来

26、说，则是致命的。 水活度即aw（wateractivity）是一个比渗透压更有生理意义的一个物化指标。它表示在天然或人为环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水的含量。各种微生物生长繁殖范围的aw值在0.9980.6之间：（3）氧化还原电势（redox potential） 又称氧化还原电位，是度量某氧化还原系统中还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标。 一般以Eh表示，它是指以氢电极为标准时某氧化还原系统的电极电位值，单位是V（伏）或mV（毫伏）。不同类型微生物生长对氧化还原电位的要求不同: 好氧性微生物：+0.1伏以上时可正常生长，以+0.3+0.4伏为宜； 厌氧性微生物：低于+0.

27、1伏条件下生长； 兼性厌氧微生物：+0.1伏以上时进行好氧呼吸，+0.1伏以下时进行发酵。氧化还原电位与氧分压和pH有关,也受某些微生物代谢产物的影响: 增加通气量(如振荡培养、搅拌)提高培养基的氧分压，或加入氧化剂，从而增加Eh值在培养基 中加入巯基乙醇、抗坏血酸（Vc，0.1%）、硫化氢(0.025%)、半胱氨酸（0.05%）、谷胱甘肽、铁 屑、二硫苏糖醇、庖肉（瘦牛肉粒）等还原性物质可降低Eh值。 测定氧化还原电势除用电位计外，还可在培养基中加入化学指示剂刃天青（resazurin） 进行间接测定 刃天青在无氧条件下呈无色（Eh-40 mV）；在有氧条件下，其颜色与溶液的pH相关；（中性

28、紫色；碱性蓝色；酸性红色）；在微量氧时，它呈粉红色。 4.经济节约 配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成份,特别是在发酵工业中,以降低生产成本。 (1)以粗代精：对微生物来说，各种粗原料营养更加完全，效果更好。而且在经济上也节约。大量的农副产品或制品，如麸皮、米糠、玉米浆、酵母浸膏、酒糟、豆饼、花生饼、蛋白胨等都是常用的发酵工业原料。 (2)以“野”代“家”： 以野生植物原料代替栽培植物原料，如木薯、橡子、薯芋等都是富含淀粉质的野生植物，可以部分取代粮食用于工业发酵的碳源。 (3)以废代好：以工农业生产中易污染环境的废弃物作为培养微生物的原料。 例如，糖蜜(制糖工业中含有蔗糖

29、的废液)、乳清(乳制品工业中含有乳糖的废液)、 豆制品工业废液、黑废液(造纸工业中含有戊糖和己糖的亚硫酸纸浆)等。 工业上的甲烷发酵主要利用废水、废渣作原料,在我国农村，已推广利用粪便及禾草为原料发酵生产甲烷作为燃料。 (4)以简代繁：某制药厂改进链霉素发酵液中的原有配方，设法减去30-50%的黄豆饼粉、25%的葡萄糖和20%硫酸铵，结果反而提高了产量。 (5)以氮代朊：以大气氮、铵盐、硝酸盐或尿素等一类非蛋白质或非氨基酸廉价原料用作发酵培养基的原料，让微生物转化成菌体蛋白质或含氮的发酵产物供人们利用。 (6)以纤代糖：开发利用纤维素这种世界上含量最丰富的可再生资源。将大量的纤维素农副产品转变

30、为优质饲料、工业发酵原料、燃料及人类的食品及饮料。 (7)以“国”代“进”： 以国产原料代替进口原料，尽量减少工业成本。国内青霉素发酵工业的迅速发展，依赖于找到了富有中国特色的培养基配方，即用廉价的棉子饼（或花生饼）和白玉米粉代替玉米浆和乳糖。 五、实验药品及仪器天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管筒、培养皿及培养皿盒、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、酒精灯、棉花、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、乳胶管、电炉、灭菌锅、干燥箱。牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏3g 蛋白胨 5g 氯化钠 10g 琼脂520g pH 7.0-7.2 水 1000mL

31、 甘露醇琼脂酵母膏5g 蛋白胨 3g 甘露醇25g 琼脂15g 蒸馏水 1000ml 7.5%氯化钠肉汤蛋白胨 10.0g 牛肉浸粉 5.0g 氯化钠 75.0g pH值7.40.1 25 Baird-Parker琼脂基础（鉴别）蛋白胨10.0g 牛肉浸粉5.0g 酵母浸粉1.0g 丙酮酸钠10.0g 氯化锂5.0g 琼脂15.0g pH值7.00.225 甘氨酸12.0g用法称取本品58.0g,加热搅拌溶解于950ml蒸馏水中,分装每瓶95ml,121高压灭菌15分钟,临用前加热溶化琼脂,冷至50左右,于每95ml培养基中加入常温解冻的卵黄亚碲酸钾增菌剂5ml摇匀后倾入无菌平皿。使用前在冰箱

32、贮存不得超过48h。质量控制和典型特征在361培养45-48h,金黄色葡萄球菌的单个菌落呈圆形,表面光滑、凸起、湿润,直径2-3mm。灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色（非白色）的边缘,周围绕以不透明圈（沉淀）,其外常有一清晰带。添加剂亚碲酸盐卵黄增菌液用法称取本品90.0g,加热溶解于1000ml蒸馏水中,分装三角瓶或试管,121高压灭菌15分钟,备用。Baird-Parker培养基在含有氮源的基础上，补充了促进细菌生长的丙酮酸钠，又含有抑制剂：亚碲酸钾，故有较好的选择性。但对于金葡萄球菌没有抑制，其能将亚碲酸钾还原为碲在菌落中心呈黑色，易于观察；加入卵黄，由于卵磷酯酶阳性特征，其菌落周围可出现

33、明显的沉淀环。 利用选择性培养基进行常见致病菌的分离是致病菌检测中的重要部分。六、实验步骤6.1 培养基的制备6.1.1 称量药品 根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。6.1.2 溶解 用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。6.1.3 调节pH 根据培养基对pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液调至

34、所需pH。测定pH可用pH试纸或酸度计等。6.1.4 溶化琼脂 固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一面加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分(水需预热)。注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。6.1.5 过滤分装 分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞，引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体分装装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。6.1.6 包扎标记 培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸，用棉绳系好。在包装纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日

35、期等。6.1.7 灭菌 上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为12120min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。6.1.8 倒平板 将需倒平板的培养基，于水浴锅中冷却到4550,立刻倒平板。其过程是：在酒精灯火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰，目的是消灭瓶口的杂菌，防止杂菌感染培养基；左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿后，立刻盖上皿盖。待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置，目

36、的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。6.2、灭菌方法 灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内 蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。6.2.1 湿热灭菌 煮沸消毒法 ：注射器和解剖器械等均可采用此法。先将注射器等用纱布包好，然后放进煮沸消毒器内加水煮沸。对于细菌的营养体煮沸约1530min，对于芽孢则需煮沸约12h。高压蒸汽灭菌法：高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm2