基因工程抗体

1、基因工程抗体生命科学学院09动物医学学号：2009082554姓名：章小蕙讲师：郑心田摘要:基因工程抗体正以其独特的优势(低免疫原性、可根据人们的意愿进行修饰等)逐渐取代动物源性单克隆抗体。)。随着基因工程、蛋白质工程等生物技术在抗体开发领域的广泛应用，适应不同需求的基因工程抗体种类越来越多样化，结构越来越合理，体内生物学效应也越来越完善，使其在治疗效果上比天然单克隆抗体更好、更广，在初步临床试验中显示出光明的前景。【关键词】:基因工程抗体；生物技术前言:单克隆抗体作为一种有效的新型生物制剂，促进了基础医学、临床医学、生物学、农学等许多生命学科的发展，尤其是在疾病预防、诊断和治疗中的作用越来越

2、重要。然而，作为体内应用，啮齿动物单克隆抗体的高免疫原性导致所有患者具有不同程度的人抗小鼠抗体反应(HAMA)，削弱了治疗的有效性并对去除抗体的器官造成毒性损伤，因此其应用受到严重限制。为了创造更理想的治疗性抗体分子，将用于制备单克隆抗体的细胞工程技术与用于生产重组分子的基因工程技术和蛋白质工程技术相结合，以生产基因工程抗体。在短短几年的研究中，该领域的发展日新月异，已成为抗体应用研究的热点。然而，随着研究的深入，许多问题已经暴露出来。目前，在基于单克隆抗体的临床治疗研究中，面临着五个最重要的问题和技术挑战(1)使基因工程抗体具有与亲本抗体一致的亲和力和特异性；(2)克服人抗动物单克隆抗体和与

3、单克隆抗体交联的人抗任何细胞毒性物质的免疫反应；(3)制备合适的细胞毒性物质；(4)符合体内药代动力学和生物分布特征；(5)高产低成本。本文综述了近年来国内外学者在基因工程抗体领域克服这些困难的努力和研究进展。1.基因工程抗体概述基因工程抗体，又称重组抗体，是指利用重组DNA和蛋白质工程技术，根据不同的需要，对编码抗体的基因进行加工、修饰和重组，通过转染合适的受体细胞表达的抗体分子。目前，有很多关于基因工程抗体的报道，有不同的分类方法，大致可以分为三类。1.1完整的抗体分子这种抗体与天然抗体分子相似，但经过修饰后，更接近人免疫球蛋白，并能在一定程度上减少HAMA。1.1.1嵌合抗体):它由基因

4、水平连接的小鼠抗体V区和人抗体C区组成。该抗体含有75% 80%的人抗体和20%的小鼠抗体，保留了原小鼠单克隆抗体的特异性，但对人体仍有一定的免疫原性。1.1.2人源化抗体也称为重组抗体、重组抗体或CDR移植抗体):通过替换三个发夹环的小鼠抗体高变区(也称为互补决定区，CDR)，构成抗原结合位点的轻链和重链均为小鼠来源，其余均为人类来源。抗体对人的免疫原性大大降低，但其对抗原的亲和力也降低。尽管通过选择与鼠单克隆抗体高度同源的抗体并改变片段区的一些关键氨基酸残基，或者通过筛选鼠单克隆抗体CDR表面的残基，人源化抗体与抗原之间的亲和力只能达到原始鼠单克隆抗体的33% 35%。此外，杂交瘤技术使得

5、在稳定的细胞系中产生任何单克隆抗体成为可能。该技术已广泛应用于科研和临床诊断治疗。小鼠单克隆抗体作为一种异源蛋白，可以诱导小鼠产生特异性抗体这是一种由人类淋巴细胞产生的理想抗体分子，不含任何小鼠来源的成分。该抗体不仅完全避免了HAMA的产生，而且对特异性和亲和力没有影响。虽然从人类细胞制备单克隆抗体的过程还不成熟，但是抗体库技术、体外亲和成熟和对转基因动物的研究已经使得产生完整的人类抗体成为可能。【1】1.2抗体分子片段该小分子抗体片段具有免疫原性低、分子量小、易于渗入靶组织并去除、不与Fc受体阳性细胞结合等优点，便于发挥与毒素的连接和免疫毒素的融合表达等其他作用；它与放射性同位素相连，背景低

6、，在体内成像定位检查时能呈现清晰的图像。1.2.1单结构域抗体也称为单结构域抗体：由单一的VH功能区组成，制备方法简便。然而，与完整抗体相比，亲和力降低了一个数量级。此外，VH暴露了最初与VL结合的疏水表面，影响了其特异性。因此，如果要应用VH，仍然需要进一步修改。【2】1.2.2单链抗体：由VH和VL连接的含有14 15个氨基酸残基的小肽相对稳定，但其亲和力低于完整抗体和Fab，这可能与肽接头的干扰有关。此外，一些单链抗体有很强的聚集趋势。因此，二价和三价单链抗体应运而生。研究表明，多价单链抗体在结构和功能上更接近亲本抗体，比单价单链抗体对抗原结合更敏感，具有更高的亲和力，并且与亲本抗体结合

7、抗原的功能几乎一致。1.2.3二硫键稳定的Fv :链内二硫键通过连接VH和VL功能区中结构固定的骨架区来整合VH和VL。该方法适用于任何Fv，因为用于连接二硫键的残基位于结构固定的框架区，并且链内二硫键远离CDRs，并且不干扰抗体与抗原的结合。因此，dsFv比scFv具有更高的稳定性和亲和力。1.2.4 Fab和嵌合Fab:Fab包括重链的VH2CH1和轻链的VL2CL。如果CH1和cl是人类起源，它们是嵌合Fab。由于两条链之间的非极性相互作用，Fab是稳定的，并且由于CH1，它易于检测。由基因工程菌表达的Fab与通过酶水解获得的Fab具有相同的功能。其表达有时低于单链抗体，这可能与细菌周质

8、中两条链的折叠有关，但其亲和力高于单链抗体，几乎与其亲本抗体一致。1.2.5分子识别单元(mru) :表达CDR的肽或非肽分子可以模拟亲代分子的特异性。已经合成了一些模拟抗体的肽类似物，并证明它们能阻断病毒和细胞的结合。仅构建并合成了一个非肽分子，完全消除了抗体对人的免疫原性。MRU分子量小，在药物动力学、生物分布，尤其是组织渗透、用药规律等方面具有优势。它可能成为成像分子和靶向分子的重要组成部分。然而，MRU是否具有与Fab和Fv片段相同的亲和力仍有待进一步证实。【3】1.3新的抗体分子抗体的一些片段连接到与抗体无关的序列上，或者被其他功能分子取代，因此这些抗体不仅具有与抗原结合的特性，还可

9、以发挥其他作用。1.3.1抗体相关分子也称为新效价抗体：通过基因剪接、化学交联等方法，不同类型的抗体分子与酶、化学药物、放射性同位素、生物毒素、超抗原等结合。抗体发挥导向和载体作用，使相关物质准确聚集在靶组织中，具有特异性高、剂量小、副作用小的优点。1.3.2双特异性抗体也称为双功能抗体：这种抗体的两个Fab片段可以同时与两种不同的抗原结合，例如特异性抗原和效应细胞。可通过化学交联、二硫键交换和两种不同特异性抗体的连接或融合来制备具有催化活性的抗体不仅能与抗原结合，还能使它们发生化学转化。这些抗体的明显功能是选择性地结合和降解在病毒、肿瘤细胞和其他生理靶细胞表面表达的蛋白质和碳水化合物抗原。此

10、外，催化抗体还参与药物、化学制剂和新物质的合成，并能为基础化学反应提供理论基础。例如，转化态是稳定的，酸碱反应和催化的亲电和亲核反应。自从成功开发了与酯水解相关的第一个转化类似物的催化抗体以来，已经建立了许多方法来提高催化抗体的反应性，包括应用蛋白质工程和设计协同因子的结合位点。最近，也有报道称抗体库用于制备切割各种核酸的抗体酶。表面表达的噬菌体抗体库也为催化抗体的生产和临床诊断治疗的发展提供了一种可行的途径。【4】2基因工程抗体生产技术2.1传统技术提取杂交瘤细胞的DNA、总RNA和mRNA，构建基因组文库或cDNA文库，利用抗体“共有引物”和逆转录聚合酶链反应技术扩增克隆所需的抗体基因，重

11、组到原核或真核表达载体中，在原核或真核系统中表达。原核宿主细胞表达成本低，可以大量生产。目前，大肠杆菌系统应用最为广泛。然而，原核细胞不能进行翻译后加工，例如二硫键的精确形成和糖基化，这在维持抗体的正确折叠和维持抗体的结构和功能中起重要作用。因此，应用真核系统表达抗体基因具有一定的意义5。如今，用于表达抗体基因的真核细胞大多是骨髓瘤细胞。这些细胞具有高表达量和良好的生物活性，但其致癌性仍有待进一步研究。因此，报道昆虫、植物细胞、酵母等表达抗体基因的情况并不少见。然而，真核细胞很难转染，效率低，产量有限。2.2抗体库技术用细菌克隆代替B细胞克隆来表达抗体库。主要步骤如下：(1)从免疫或非免疫B细

12、胞中分离抗体可变区基因；(2)抗体基因片段的聚合酶链反应扩增和随机克隆到相应的载体中，形成组合文库；(3)转化细菌，对表达产物进行多轮抗原亲和吸附，最终筛选出所需抗体，并大量生产抗体。表面表达的噬菌体抗体库是这项技术的突破。在丝状噬菌体(M 13，Fd)外壳蛋白基因的信号肽序列和编码成熟蛋白的序列之间插入外源基因不会影响其表达系统。外源蛋白在噬菌体外壳蛋白的N端融合表达，能自发折叠成自然状态，具有生物活性，不形成包涵体。它在筛选过程中没有检测到细菌克隆的可溶性表达产物，而是在噬菌体载体转化细菌后融合并在噬菌体颗粒表面表达的噬菌体抗体。通过多轮抗原吸附、洗脱和扩增，最终筛选出所需的抗体克隆，大大

13、简化了筛选过程。6与杂交瘤技术相比，抗体库技术具有更小的筛选范围和更短的时间，并且获得了人抗体。然而，要获得高亲和力的抗体，需要以免疫为基础，这在某些抗原上有很大的局限性。2.3体外亲和成熟在抗体应答过程中，二级应答抗体的亲和力明显高于一级应答抗体，这是一种亲和力成熟的现象。抗体库技术不包括诱导突变的过程，多次免疫人体存在很大的局限性，因此模拟体内过程和体外诱导突变成为获得高亲和力的一种途径。目前，主要的方法是定点突变(取代关键位置的氨基酸)和随机突变(导致大量的随机突变用人免疫球蛋白基因组代替动物免疫球蛋白基因组，用相应的抗原免疫动物获得人抗体。中国学者使用基因敲除和替换的方法来制造产生嵌合

14、抗体的小鼠。抗原免疫后，血清中产生的特异性嵌合抗体的效价和亲和力与野生型小鼠没有差异。国外学者将大片段的DNA引入小鼠B细胞，重排V (D)J，并在B细胞表面表达。抗原免疫后，它们有高突变，表现出亲和力成熟和免疫球蛋白类转化，并产生完整的人抗体。美国BM S公司和GT公司致力于转基因山羊的研究。绵羊分泌的乳汁中含有大量的BR96单克隆抗体(抗Le相关糖抗原单克隆抗体)，有望用于治疗结肠癌、乳腺癌和肺癌。转基因动物是产生人类抗体的最理想的方法，但是这项技术很困难，并且超过了目前的水平。只有包括转基因动物技术改进在内的大规模基因组工程才能取得真正的突破7。3.基因工程抗体的临床研究3.1基因工程抗

15、体可以灵活多样地构建，不仅可以通过减少抗体中的小鼠成分来降低免疫原性，还可以将抗体的一些片段与其他功能分子连接起来，使抗体不仅可以与抗原结合，还可以发挥其他效应分子的生物学作用。基因工程抗体在医学的许多领域都有巨大的潜力，特别是在肿瘤疾病的诊断和治疗以及抗感染方面。3.2在肿瘤疾病的诊断和治疗中的应用被称为放射免疫显像，通过将标记抗体注射入人体来显示抗原和抗体在肿瘤部位的结合。成像效果受抗体亲和力、特异性、半衰期和组织穿透性等因素的影响。同时，使用小鼠单克隆抗体会引起人抗小鼠抗体的反应，改变抗体的药代动力学，并导致显像失败和副作用。基因工程抗体可以解决上述问题，而基因工程抗体，如单链抗体、F(

16、ab)等。分子量小，可快速去除，组织穿透性强，成像背景低，更适合放射免疫成像。恶性肿瘤的靶向治疗是将抗肿瘤相关抗原抗体与毒性蛋白如假单胞菌外毒素、蓖麻毒素、白喉毒素或细胞因子如白细胞介素、肿瘤坏死因子、干扰素融合，可将细胞杀伤作用导向肿瘤部位，直接杀伤肿瘤细胞或动员免疫系统杀伤肿瘤细胞。3.3基因工程抗体的抗感染作用疫苗和抗生素常用于预防和治疗感染性疾病，但对诸如非典和艾滋病等病毒感染仍没有有效的治疗方法，这些病毒感染很难获得相应的疫苗或疫苗效果不令人满意。在这方面，基因工程抗体的应用前景非常广阔。例如，在艾滋病的治疗中，通过抗体工程技术成功制备了抗艾滋病病毒整合子的单链抗体结核菌2-19，它能有效抑制艾滋病病毒感染的早期和晚期，有望成为艾滋病基因治疗的有效手段。Seko等人使用抗CD40L/B7-1单克隆抗体研究急性病毒性心肌炎。结果表明，单克隆抗体能明显减轻心肌炎症，防止心肌损伤。此外，Ry