PCR整套SOP文件

1、.程序文件的管理和维护制度1. 目的：基因诊断程序文件是指导临床基因扩增检验活动的法规性文件，属内部受控文件，不得擅自修改、涂改，不得遗失、外借翻印。为保持其现行有效和持续适应性，并确立因条件变化进行修改的程序。 2编写依据： 2.1 ISO/IEC1702501999检测和校准实验室能力的通用要求因卫生部临床基因扩增检验实验室技术验收表（check list）是根据ISO/IEC17025而设计 2.2 卫生部临床基因扩增检验实验室管理暂行办法及临床基因扩增检验实验室工作规范 3适应范围：临床检验标本 4内容：程序文件应包含下列内容：文件名称、编号、页号、总页数 例：页眉 文件名称 程序文件

2、的管理和维护 编号日期 年 月 日版本责任部门第 页 共 页页底应有：编写人： 批准人： 生效日期：年月日。 5编制及职责：程序文件由PCR实验室负责人主持编写、修订、审核并保持它的现行有效性。由科主任批准和颁布实施，并负责解释。 6发放与持有者责任：程序文件由科主任批准发放，发放与回收要登记签字，由PCR实验室负责人保管，并组织全室工作人员认真学习，了解内容，熟悉其中各项规定，程序文件执行情况纳入实验室目标管理，与奖惩挂钩。持有者调任时，要收回该程序文件。 7修订：科室任何工作人员均可提出对程序文件的修改建议，文件修改须经有关人员讨论，PCR实验室负责人根据条件变化提出是否修改的决定，如作小

3、的修改则可在修改页上进行，修改文件经科主任审核批准后，并填写入程序文件修改页。如果文件须作重大修改，PCR实验室负责人可进行改版。新版程序文件经科主任批准后生效，收回旧版，并予以销毁，登记签字后发出新版，保证工作现场只有唯一的，最新的使用版本。 实验室内务管理及清洁制度1 目的：保证实验室日常内务管理及清洁工作顺利进行。2 范围：实验室相关人员及医院清洁工人。3 内务管理及清洁制度3.1内务管理制度a.实验人员要有强烈的时间观念，按时上下班，不迟到、早退。b.进入实验室的工作人员必须遵守实验室的单一流向的规定，禁止逆向走动。c.非本室工作人员未经允许不得进入实验室。d.实验室工作人员应严格遵守

4、各项规章制度和操作规程。f.实验结束后，做好实验室的清洁卫生和消毒工作。g.确保实验室的安全。工作人员每天下班前应认真检查实验室的门窗、水电，节假日应指定人员负责检查实验室的仪器、设备，确保安全。h.实验室为工作学习场所，非实验相关物品不得放置在实验室内，落实实验区和生活区分离的原则，严禁在室内抽烟，吃零食.i.在实验室内不得从事读报、看小说等非实验性工作。j.实验室人员应自觉遵守以上规定，如有违反按科有关规定处罚。3.2内务清洁制度实验室人员：a实验室地面必须平整、干净，通道要利于通行，没有无用的物品阻碍。b.合理规划实验室内物品，做到摆放整齐、有序，无用的或使用效率低的物品放置到储存处，常

5、用的物品要容易寻找到。c.抽屉、柜子、文件类物品要作好标记，以方便识别。d.实验结束后用4%“84”消毒液对台面进行清洁，并经紫外灯进行消毒。e.每天对使用过的移液器用75%的酒精进行擦拭，并经紫外灯进行消毒30分钟。f.实验过程中如发生标本或试剂外溅，应立即用4%“84”消毒液滴上，卫生纸盖上半小时，然后用酒精擦洗，并经紫外灯消毒。g.每天实验前通过缓冲区上的开关，开启各区的通风系统，各区实验结束后打开该区移动紫外灯消毒实验台面，紫外灯每天开启 3060分钟。h.每天下班前要关门、关窗、检查空调和仪器的电源是否关闭。医院清洁人员：a.每天实验结束，待紫外灯消毒时间足够后，依次关闭各区紫外灯并

6、记录。 b.依次用4%“84”消毒液清洁三个区的实验台面和地面。各区清洁消毒工具均专用，不可混用，注意按照单一方向流程的原则来进行清洁。c.收集好各区废弃物，交医院集中处理。d.每周一，四将工作服交院洗衣房洗涤消毒，不同实验区的工作服隔开洗涤。4 引用表格：附表18: PCR实验室出入人员登记表实验室的设置及管理1. 目的：建立实验室的合理设置和科学管理，防止实验污染,保证检测结果的可靠性。2. 适用范围：有关实验室的管理、设置、设备、工作流程及维护等应遵守规程。核心是防止分析前、分析中和分析后的实验污染、实际工作中主要是扩增片段（扩增产物）、天然核酸、标本间、试剂和耗材及不当的操作方法所造成

7、的污染，尤其是要避免实验室已扩增的PCR产物污染新检测标本中PCR体系。3. 职责：临床PCR检验实验室工作人员共同遵守、相互督促。4. 程序：4.1实验室分区设置a.本实验室布局见附图01。实验室采用实时荧光定量PCR技术作为临床基因诊断的主要手段，实验室分为试剂准备区、标本制备区和扩增及产物分析区三个独立实验室，连接部位设置一个缓冲区，用于更换工作服、鞋套等；每一工作区各配备专用的设备、仪器、辅助设施、耗材、清洁用品、办公用品、专用工作服，并有明显的区分标识。进入各个工作区域进行基因工作扩增时,必须严格遵守单一方向顺序,即从第一区试剂贮存及准备区第二区的标本制备区第三区的扩增区。b. 各工

8、作区有专用的仪器设备、办公用品、工作服、实验耗材和清洁用具等，不可混用。c.各区配有不同颜色工作服，一区为蓝色，二区为粉红色，三区为白色。进入实验室，必须更换本室有颜色标识的工作服，穿上一次性鞋套。4.2标本接收区工作制度a.因我室每周一，三，五才开展项目，为避免频繁进入标本制备间，标本的接收在标本收集间进行，收集后暂放于储存标本的专用冰箱。b.每天下班前收齐标本，验收登记后，将标本送入标本制备区。 出去后当天不得再进入实验室。c.每天的标本登记记录，应书写工整详细，使用本室专用的、带有本室标识的记录本、纸和笔。4.3试剂准备区工作制度a实验人员进入该区须穿本区专用蓝色工作服。实验中须戴手套、

9、一次性鞋套。b.在缓冲区开启该区的通风系统c记录温、湿度计读数。d.记录冰箱的温度计读数，绘制冰箱的质控图（附图02）。e.根据当天的标本验收登记表，取出当天实验须配制和使用的试剂，其余试剂要立即收好放回冰箱内。f.每周一清点库存试剂，看有无过期或将近到期的试剂，或作报废处理或排列优先使用，避免浪费，然后记录试剂的详细保存情况。g.将准备好的试剂放入传递盒中。h.每次实验记录，书写工整详细，应使用本室专用的、带有本室标识的记录本、纸和笔。i.实验完毕关闭该区的通风系统并打开紫外灯消毒3060分钟，记录紫外灯使用情况。4.4标本制备区工作制度a.实验人员进入该区须穿本室专用粉红色工作服。实验中须

10、使用一次性鞋套，戴手套，手套需常更换。b. 在缓冲区开启该区的通风系统。c从传递盒中取出试剂放入冰箱冷冻室试剂存放专区暂存。d.室验前打开生物安全柜的送风和排风按键，打开紫外灯消毒1530分钟。e.记录温、湿度计读数。f.记录冰箱的温度计读数，绘制冰箱的质控图。g.核对标本的编号、类型和标本数量。h.按试剂盒要求在生物安全柜里进行标本的裂解和提取处理，在工作台面上进行加样，加样后高速15000rpm离心数秒后，将其放入传递盒。i.使用本室专用的经过灭活无菌处理的加样器和带滤芯的吸头。j.使用过的离心管、吸头须置于盛有4“84”消毒液的废液缸中。k.使用本室专用的带有本室标识的记录本、纸和笔。l

11、.患者样品应按有生物传染性危险品对待。m.标本处理完成后，收拾台面，用4%的84消毒液全面擦试生物安全柜内的工作台面，开紫外灯消毒30分钟。n.关闭所有仪器，记录仪器使用时间和运行状态。 o.实验完毕关闭该区的通风系统并打开紫外灯消毒3060分钟，记录紫外灯使用情况。4.4扩增区工作制度a.实验人员进入该区须穿本区专用白色工作服。实验中须使用一次性鞋套，戴手套，手套需常更换。b. 在缓冲区开启该区的通风系统。c.将从传递盒接收来的离心后加好样的反应管上机扩增。d.扩增分析完后，记录结果，打印报告。e.得到当天室内质控结果后，在室内质控图（附图03）上描点。f.关掉扩增仪，将扩增过的反应管小心地

12、取出放入密封的塑料袋里丢入医疗垃圾袋中，记录仪器使用时间和运行状态。g. 实验完毕关闭该区的通风系统并打开紫外灯消毒3060分钟，记录紫外灯使用情况。本文涉及以下图表，见SOP文件末的附图表：实验室平面布局示意图-附图01冰箱质控图-附图02室内质控图-附图03实验室人员配置及培训程序1. 目的：保证实验室有足够数量的合格的工作人员，并能完成相应的工作任务。2. 适用范围：本程序适用于实验室人员配置、管理、培训及考核。3. 程序：31 人员要求：3.1.1本实验室工作员应为医学检验专业或相关专业毕业，具有大专以上学历。3.1.2 实验室工作人员应参加卫生部或省临检中心举办的PCR技术培训，并取

13、得合格证。3.1.3 对于新进入本室的人员，如尚未取得PCR技术培训合格证，应在实验室有培训合格证的上级技术人员的指导下进行实验工作，实验报告由有资格人员出具，并应在最短的时间内取得上岗培训合格证。3.2 人员配置：3.2.1 实验室应根据工作需要配备足够的工作人员，目前实验室有副主任技师1人、主管技师1人，初级技师2人，获得培训合格证者2人，视工作量的增加和业务发展需要，应适当增加工作人员。3.2.2科室主任负责PCR实验室人员配置、监督质量、实验室所有工作人员在条件许可时，应在最短时间内获得上岗培训合格证书。工作人员上岗前必须学习掌握PCR实验室管理文件及要求，并由实验室主任核查。实验室主

14、任具体负责实施技术培训、考核及管理。3.23实验室主任负责实验室管理、技术指导、解决与临床沟通及技术疑难问题。实验室主任不在岗时，应指定临时负责人。3.3 人员培训及考核：3.3.1 实验室负责人（或委托人）参加每年卫生部PCR室间质评总结会。3.3.2 实验室工作人员每12年至少参加1次PCR技术的省级或国家级继续教育项目，参加相关学术交流会议。3.3.3 安排未取得上岗培训合格证的工作人员在合适的时间内参加技术培训。3.3.4 实验室工作人员每年应提交至少1篇本专业相关学术论文或综述作为年度业务考核的依据之一。3.4 人员管理实验室建立所有工作人员的技术档案，包括：学历、任职资格、发表论文

15、、研究成果、培训等相关材料复印件（检验科统一管理）。4. 引用表格：4 1实验室工作人员一览表(附表02)；4 2人员培训计划及培训记录表(附表05)。仪器申请、采购、安装和管理程序1目的：保证仪器正常的购买、安装、使用，确保实验室仪器设备得到妥善的管理。2适用范围：基因扩增检验实验室所有的仪器设备。3申请、采购及安装程序3.1 仪器申请购买需根据实验室需要由实验室工作人员提出并向实验室负责人进行书面汇报。3.2 由实验室负责人填写仪器设备申购表，通过科室领导小组会议批准后，上报医院设备科统一进行购买。3.3 仪器采购到货后，在医院设备科人员和实验室人员共同陪同下由厂家到实验室进行安装。3.4

16、 仪器安装后由厂家工程师进行培训并通过设备科人员确认后，填报仪器安装表后，设备科和实验室各备份一份仪器维护使用档案后，由实验室负责人签字后方可使用。4 管理程序：4.1 基因扩增检验实验室的主要仪器设备均需建立档案，主要的仪器包括：XXXXX扩增仪、高速离心机、普通低温冰箱、移液器、超净工作台、生物安全柜等。4.2 设备的档案包括：设备名称、制造商名称、型号、序号、接收日期和启用日期、目前放置地点、接收时的状态、校准和鉴定的日期和结果以及下次校准的日期、进行的维护和维护计划、故障记录等，并应有仪器使用说明书或其它技术资料复印件。4.3 仪器出现故障应作记录和处理意见，如不能正常使用，应填写维修

17、申请单，交医院设备维修人员或相关专门维修单位进行处理。4.4 仪器应有工作状态标识，正常使用者贴绿色标签。有故障待修暂停使用者用黄色标签，不能使用者应贴红色标签。需定期作校准或检定的仪器应有校准或检定日期及下次校准或检定日期的记录。4.5 仪器设备的报废经提出申请后，由科有关人员统一处理。4.6 基因扩增检验实验室仪器设备实行分区使用，不得混用。4.7 本实验室所有仪器、设备均为专用不外借。本文涉及以下表格，见SOP文件末的附图表：主要仪器设备一览表（附表03）。设备校正记录表（附表08）。实验室试剂、耗材购买管理程序1. 目的：规定试剂购买原则、验收的程序和试剂的正确贮存。2. 范围：适用于

18、本实验室所购的诊断试剂盒、实验耗材。3. 职责：本程序由科主任落实，室负责人主管协助。4. 工作程序：4.1 试剂的购买和管理4.1.1试剂购买原则：试剂的购买须根据科内的有关规定本着“质优价廉”进行，所购基因诊断试剂必须三证齐全（生产许可证、产品注册证、经营许可证），并与荧光定量扩增仪相配套。4.1.2试剂购买程序：试剂厂家的确定：先由具体项目操作人员提出初步意见，提供2家或2家以上（特殊情况1家亦可）试剂厂家的有关试剂信息（包括试剂厂家的信息广告、同行对有关试剂盒的使用评价和有关机构的综合评价），提交科试剂审核小组讨论决定第一试剂商和第二试剂供货商，并与供货商商谈试剂价格；试剂的购买：具体

19、项目操作人员每月底提出所购试剂的品种和数量，由实验室负责人或委托人与供货商联系供货；试剂厂商的变更：为保证试剂使用的稳定性，原则内一年内不变更试剂厂商，如在使用过程中发现质量问题，由室负责人向科主任提出申请，交试剂审核小组讨论决定。4.1.3试剂的验收：供货商送来试剂后由科专门人员和项目操作人员共同验收，在厂家的供货清单上签字，项目操作人员负责试剂质量验收（内外包装），科专门人员核对试剂的数量和价格，供货清单交室负责人保管；试剂验收后登记。4.1.4 试剂贮存：试剂登记后，及时放入试剂贮备区的冰箱，保存条件按说明书规定进行。4.1.5试剂的质检：按试剂质检SOP进行。4.2实验耗材的购买和管理

20、4.2.1购买：由实验室负责人填写申请，按需提出所购耗材的品名、规格、数量，由科主任签字同意后交科室指定人员送交院设备科购买。4.2.2 验收：消耗品购进后由科专门人员验收、领进检验科，交实验室人员，实验室人员核对数量、规格，查验外包装是否破损，如发生破损，给予退回。4.2.3 贮存：消耗品按要求存入各区指定位置。4.3项目具体负责人发现试剂或耗材少于一定的数量时（不足2周使用时），应向室负责人提出，以便及时购买；使用过程中发现试剂有质量问题时向室负责人提出，由室负责人核实后采取措施。5. 引用的文件及表格试剂的质检标准操作程序试剂验收记录表（附表11）试剂的质检标准操作程序1目的：保证每批用

21、于临床实验的试剂的质量良好，符合。2适用范围：各种用于临床实验的核酸扩增荧光检测试剂（现包括HBV、HCV、TB、CT、UU）3质检步骤3.1收到试剂后，目测试剂是否处在冻存状态。3.2核对试剂品种和数量并检查包装：外包装（厂名厂址、检测项目、批准文号批号和有效期等）；内包装（试剂瓶完整性、真空包装完整性、试剂品种完整性、使用说明书有否等）。3.3及时将试剂转入冷冻冰箱保存。将上述检测核对情况在记录本上登记。3.4最迟在前批次试剂存量尚可维持常规实验一周时，按如下要求对新批号试剂进行效验实验。3.5效验实验要求设置：空白对照、阴性对照，阳性标准品梯度（104、103、106、107）。3.6出

22、现如下情况中任何一种的，判断为试剂不合格，不能用于临床检测：a）空白对照出现扩增（出现阳性结果）。需重复实验确证试剂污染。b）阳性对照和阳性标准品均未检出（阴性），或阳性对照未检出而阳性标准品检出率大幅下降，表示试剂失效或检测灵敏度大幅下降。3.7阳性对照未检出，阳性标准品检测正常，提示样品提取液可能存在问题。重复新旧提取液阳性对照实验，确定提取液失效问题。更换提取液后该批试剂方可使用。3.8空白对照无扩增，阴性对照有扩增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。单独用提取液点样上机，出现扩增，需更换提取液后方可使用该批试剂。3.9 阳性对照检出，阳性标准品未检出，提示阳性标准品存在问题。更

23、换阳性标准品后该批试剂方可投入使用。3.10空白对照、阴性对照无扩增，阳性对照正常检出，阳性标准品导出的标准曲线均在使用范围内，表明该批试剂良好，可以投入临床使用。3.11将实验结果归入记录。实验耗材质检的标准操作程序1目的：保证耗材的使用质量不会影响检测工作的正常进行。2.适用范围：核酸扩增荧光检测实验室常用耗材：1.5ml离心管、0.5ml离心管、带滤芯的吸头。3、操作步骤3.1检测1.5ml离心管3.1.1目测:检查离心管有无畸形、破损、不能闭盖的情况。3.1.2实验检测(每批随机抽样离心管50个用于实验检测)。a.将抽取的50个目测合格的离心管插在浮板上,置于沸水浴锅中20分钟后取出，

24、如发现有爆开情况发生，即认为该批离心管不符合本实验室实验要求，作退货处理。b.再将这50个离心管加半量生理盐水后，1万转/分离心20分钟，如发现有管盖爆开或漏液情况发生，即认为该批离心管不符合本实验室实验要求，作退货处理。c.经上述检测未发现不合格情况后，即启用该批耗材。3.2检测0.5ml离心管 方法、步骤同上。3.3检测带滤芯的吸头331检查吸头有无畸形、破损的情况，如无以上情况则做以下质检。332滤心漏气检验：配制1%-2%甲基橙的水溶液，如果吸头的最大体积为100ul，则将加样器吸取体积调至110120ul（如果吸头的最大体积为200ul，则将加样器吸取体积调至210220ul；如果吸

25、头的最大体积为10ul，则将加样器吸取体积调至1112ul），再套紧吸头，吸取甲基橙溶液，如滤心中有甲基橙溶液透过，表示滤心漏气，不能用于PCR检测，作退货处理。如果滤心中无甲基橙透过，则再检测10个吸头，假若都未发现滤心漏气现象即可启用该批吸头。333吸头是否含抑制物、是否能有效防止气溶胶污染的检验：先纯化制备3份强阳性和10份阴性核酸标本，然后使用待评价带滤心吸头对强阳性样本来回吸取10次（模拟10份阳性样本的吸取），将最后一次的吸取液加至一含扩增反应液的管中，之后，换一个新吸头，连续吸取10份阴性样本分别至10个扩增反应管中，此过程重复35次，最后对每一管按所用试剂方法进行扩增检测。强阳

26、性样本如为强阳性，则可启用该批吸头；如出现阳性弱或出现阴性则说明吸头可能含有扩增抑制物，不能用于PCR检测，作退货处理。所有阴性样本如为阴性，则可启用该批吸头；如出现阳性则表明吸头不能有效地防止气溶胶对加样器的污染，不能用于PCR检测，作退货处理。备注：实验耗材在目测合格后基本上都可以初步通过验收。如果在目测不合格或目测合格后出现甚至频繁出现爆管、堵塞、漏液、漏气等情况下，再由实验人员进行实验检测。本文涉及以下表格，见SOP文件末的附图表：消耗性材料验收记录表-附表12实验室化学试剂的管理和配制标准操作程序1目的：保证实验中用到的各种溶液符合实验要求。2.适用范围：核酸扩增荧光检测实验室常用溶

27、液：4NaOH溶液、75的酒精（由医院药剂科提供）、4%84消毒液。3. 管理程序：3.1 化学试剂的购买或领用：每月清点一次试剂，发现试剂存量不足时，及时领用或提交请购申请。发现有试剂过期或明显变质时要立即报废，并将报废试剂妥善处理。3.2 化学试剂贮存：临床基因扩增实验室常用化学试剂均置于避光、阴凉、干燥处保存。实验中常用到的一些化学试剂则根据要求保存于不同环境（如预冷乙醇保存于4）。PCR试剂一律贮存于-20。3.3 化学试剂使用：临床基因扩增实验室常用化学试剂均无毒性或仅有低腐蚀性，故使用时主要应注意分类、分区保存、关注失效日期和使用后的及时清洁等。4配制4.1用具 干燥洁净的1000

28、ml量筒一只，200ml量筒一只，50ml量筒一只，三角烧瓶两只，天平一架，250ml、1000ml广口瓶各一只。4.2配制步骤4.2.1配制4% NaOH溶液a.用天平称取4克分析纯的NaOH固体，置于一只三角烧瓶中。b.用200ml量筒准确取100ml蒸馏水，缓缓注入盛放NaOH固体的三角烧瓶中。c.摇荡三角烧瓶使NaOH固体充分溶解。d.然后缓缓倾倒入250ml广口瓶中密封保存备用。3.2.2配制4% 84消毒液a.用50ml量筒准确取40ml84消毒液原液，缓缓注入一只三角烧瓶中。b.用1000ml量筒准确取960ml水，缓缓注入盛84消毒液的三角烧瓶中。c.摇荡混匀溶液, 将混匀的溶

29、液转移入广口瓶中。323配制1%-2%甲基橙溶液a.用天平称取2克分析纯的甲基橙固体，置于一只三角烧瓶中。b.用200ml量筒准确取100ml蒸馏水，缓缓注入盛放甲基橙固体的三角烧瓶中。c.摇荡三角烧瓶使甲基橙固体充分溶解。d.然后缓缓倾倒入250ml广口瓶中密封保存备用。5.2.4配制75酒精溶液a一般常规消毒的75酒精由医院药剂科提供。b.RNA提取的75酒精的配制，试剂盒提供DEPC水，酒精用分析纯的无水酒精。c.根据当天的标本数量配制。注意事项：每份配制好的溶液保质期为14天。本文涉及以下表格，见SOP文件末的附图表：附表16: PCR实验室试剂配制登记表废弃物的处理及生物防护措施1.

30、 目的：确保废弃物得到恰当的处理，防止污染环境。预防工作人员在实验过程中被感染或污染。2. 范围：实验室所有废弃标本、使用过的耗材等。实验人员和外部环境的生物防护。3. 废弃物处理3.1 实验室所有垃圾，送医院垃圾处理站。4.5 污染的标本容器、吸管及注射器等投入盛有消毒液（4%的“84”液）的容器内浸泡一昼夜后再进行洗涤。4.6 污水和标本不能直接流入下水道，必须经过污水处理后再流入下水道。4.7 无需保存的检验标本，不论检验结果如何，均需高压灭菌或煮沸灭菌，或用强力消毒液处理，污染的纸集中收集焚毁，污染的布可进行高压灭菌。4. 4.8 对各种有毒化学试剂应用后，要做相应的无害化处理，防止污

31、染环境。5. 程序：3.1 工作人员在实验过程中应严格遵守相应的操作规程。3.2 感染途径：3.2.1 空气传播：如气溶胶3.2.2 直接接种：工作中偶然的针刺、碎玻璃划伤直接引起传染。3.2.3 皮肤、粘膜接触：临床标本中的感染源通过破损皮肤，粘膜接触造成感染。3.3 预防措施：3.3.1 所有来自病人的血液或体液标本均应视作传染源，因此在标本的采集、运输过程中，标本容器应完好无泄漏。3.3.2 处理标本时应穿工作服、戴手套，以免沾上皮肤。如手或其它部位的皮肤沾上血液或体液标本以及试剂，应立即冲洗干净。3.3.3 在实验过程中，病人标本（血液、体液）或试剂不慎溅入眼内应立即用清水洗。3.3.

32、4 实验过程中在使用针具等锐器时，尽量小心防止受伤。若被锐器刺破时，应立即脱下手套，尽量挤压伤处，使血流出，然后用碘酒、酒精消毒，必要时进行预防补救措施（如HBV DNA阳性时可及时注射高效价的HBV特异性免疫球蛋白）。3.3.5 在实验过程中病人标本（血液、体液）外漏工作桌面或地面时，应及时用4% 84消毒剂清洁桌面及地面，然后用清水擦净。 3.3.6 实验完毕离开时，应脱下所有该实验区个人防护装备。3.3.7 实验完毕后应对实验室进行紫外消毒。4本文涉及以下表格，见SOP文件末的附图表：附表17: 医疗垃圾处理登记表临床标本的采集及处理操作程序1. 目的：规范临床待检标本的正确采集、送检和

33、处理。2. 适用范围：基因扩增检验实验室的所有临床检测标本。3. 职责： 所有采集标本的人员均需按本SOP操作，实验室工作人员有责任向临床医生、护士或病人宣教。4. 操作程序4.1 本实验室检测标本为：血清或血浆、痰、生殖道拭子标本、尿液及脑脊液和胸腹水。4.2 血液标本：用真空采集管采集血液标本，病区标本由护士采集，门诊标本由门诊抽血处专人采集，血标本采集后在2小时内送达实验室。实验室工作人员对标本进行查验，如标本采血量不足、严重溶血、采样时间过长（特别是进行RNA检测时）或出现其它不合要求的情况，应拒收标本，登记并告知相关科室。4.3 痰标本：用带盖的无菌一次性塑料瓶收集清晨第一口痰标本送

34、检。（对于无痰或少痰的患者，可用45加温的100g/L NaCl水溶液雾化吸入或改变体位以使痰液易于咳出；对于小儿可以轻压胸骨柄上方以诱导咳痰，用消毒棉拭子刺激喉部引起咳嗽反射，用棉拭子采集标本。）标本在室温下保存不能超过24小时。样本处理时，在样本中加入2倍体积的4%NaOH溶液，吹打均匀后于室温放置30分钟使之液化。取液化后的痰标本1ml于1.5ml无菌离心管中，15000r/min离心10min，弃上清，在沉淀中加TE溶液1ml（自备）混匀，15000r/min离心10min弃上清，重复上述洗涤步骤一次。沉淀中加入50ulTB DNA提取液，震荡混匀后100摄氏度沸水浴15分钟，1500

35、0r/min离心10分钟备用。4.4生殖道拭子：尿道或阴道分泌物由医生用专用取样拭子（灭菌，一次性）采集样本，及时送检。采集生殖道拭子标本，要求病人在采样有2小时内不能排尿，采样时，将棉拭子伸入男性尿道及女性宫颈口23cm，转动一周以获得上皮细胞。将取样后的棉拭子放入含1ml无菌生理盐水离心管中洗涤片刻，在管壁上挤干后丢弃拭子，13000rpm离心10min，弃上清，保留沉淀。4.5 尿液：由病人自留尿液于无菌封闭的试管中送检。取1ml于无菌离心管中，13000rpm离心10min，弃上清，保留沉淀。4.6 脑脊液和胸腹水：由临床医生采集后放入消毒的试管中及时送检。取1ml于无菌离心管中，13

36、000rpm离心10min，弃上清，保留沉淀，置-20保存。标本接收、拒收及保存程序1 目的：本程序是对分析前标本的质量管理，是与确保检验质量为临床提供准确有效结果密切相关，实验室工作人员必须重视标本的采集、处理、贮存、安全处置等全过程。2 范围：PCR扩增的临床各类检测标本；3 职责：PCR检测实验室现有工作人员须熟知标本的采集、处理、贮存、安全处置等全过程。并有责任向临床医护人员进行宣传培训如PCR项目选择、标本采集、运用、处理等技术要求和注意事项。4 标本的唯一性标识：标识由三部分构成：检测项目、标本采集日期、该检测批次的标本序号，三部分间无间隔符号，例如：B111210001 分别表示

37、实验项目、年、 月、 日、 序号，序号（001-999），整个标识为10-11位；41由于标本容器太小，对应标本唯一性标识，产生工作标本序号，其组成有检验项目加序号（1-99）。HBV用B表示、HCV用C、TB用TB、CT用CT、UU用UU表示等。42标本种类用中文表示：全血、血清、血浆、痰、尿、分泌物、各种穿刺物、组织等。43 标本的唯一性标识须字迹清晰明了，不得随意作任何涂改；必须时，在旧标识上划双线更改，更改后应保持旧标识可辨识。5. 标本的接收:5.1 所有标本均可能具有传染性，须严格遵守医院有关院内感染及医用垃圾的管理和处理规定，工作人员须注意保持并随时检查容器的完整和无标本外泄发生

38、。5.2 接收标本时应核对标本与检验申请单的一致性。工作人员有权拒收与检验申请单不一致的标本、标识不清的标本。检验申请有不清晰情况时，应即时与临床科室或相关人员联系核实。5.3标本接收人须检查标本状态.5.4 标本合乎要求，须在可接收标本记录本上按内容记录，作进一步处理，标本不合乎要求，须在记录本上记录拒收原因。6. 标本的拒收: 标本在下列情况下，视为不合格，工作人员有权拒收标本； 无被检标本基本信息或与申请单不符合（姓名、年龄、性别、住院号、检验项目等） 使用不适当的容器； 容器有破损； 标本外泄污染； 标本溶血； 标本量不足 其它如后续处理过程中发现的不合格，应记录其状态并通知临床重新送

39、检。对拒检的不合格标本应登记在拒收标本记录本上。填写不合格标本处置单，并随同申请单送返送检科室。必要时电话告之相关科室医生或护士。7. 标本的保存:7.1处理前的标本保存：a）HBV：全血样本可4下短期（12周）保存，或分离出血清（血浆），保存于-20下。b）HCV：在室温下1小时内分离血清，吸取200l，保存于-20。尽可能快的提取RNA。c）TB：液化的痰标本如果不立即用于核酸提取，可保存于-20下。处理后的痰或胸腹水、脑脊液、脓液用于TB检测的标本可置于4下短期保存。长期保存于-20下。d）CT和UU：处理后的沉淀标本可置于20下短期保存。7.2报告发出后的标本保存：a） 提取的核酸标本

40、当天检测可置4保存，如当天不检测应置-20保存。报告发出后丢弃。b） 原始血清/血浆样本在报告发出后放入低温冰箱-20保存3个月，以备查。超过3个月保存期的标本由室负责人酌情处理，一般按生物传染性物品交医院统一处理。c）血清/血浆标本放置低温冰箱保存时须有记录，按检测项目分类存放，并由专人负责管理。10引用的表格：10.1标本接收记录表（附表13）。10.2拒收标本记录表（附表14）标本前处理标准操作程序1目的：保证标本处理标准化、规范化，使不规范操作因素对实验结果造成的影响减至最小。2适用待处理标本范围：乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、沙眼衣原体、解脲支原体、结核杆菌。3标准操作程序3.1乙型肝

41、炎病毒（DNA血清）a）双手戴上手套，从冰箱取出标本，将化验单和试管依次编号后，弃去手套。b）双手换上新手套，用镊子(夹取灭菌物品专用)取出0.5ml离心管，对应标本编号，置于离心管架上。c）将移液器调到100l，先混匀样品处理液A，再吸取100l加入到已编号的0.5ml离心管中。盖上管盖，振荡混匀，13000r/min离心10分钟。吸弃上清液，再加入25l样品处理液B . 振荡混匀，低速（2000rpm）离心数秒后100度干浴或沸水浴10分钟.d）13000 rpm 离心10分钟取上清液为PCR反应模板。（上清液不立即使用，须置-20度保存，重新使用时需13000 rpm 离心10分钟。）e

42、）收拾台面至准备状态。3.2丙型肝炎病毒（RNA血清）a）双手戴上手套，从冰箱取出标本，将化验单和试管依次编号后，弃去手套。b）双手换上新手套，用镊子(夹取灭菌物品专用)取出0.5ml灭菌离心管，对应标本编号，置于离心管架上。c）1.1将样品处理液A置70加热510分钟，融化后混匀备用。1.2在样品处理液B中加入6ml无水乙醇，混匀备用。1.3在样品处理液C中加入16ml无水乙醇，混匀备用。 1.4在去抑制剂中加入700uI灭菌纯化水，溶解后混匀备用。 1.5准备实验所用的无水乙醇4ml。d）核酸提取（在标本处理区进行）待测样品处理将阴性对照、工作标准品、工作标准品、工作标准品、工作标准品与待

43、测标本同步进行处理）2.1用带滤芯吸嘴吸取20ul去抑制剂于0. 5ml离心管中。2.2加入100ul被测标本，用带滤芯吸嘴反复吸打3次。2.3再加入l00ul样品处理液A，盖上管盖，振荡混匀，离心数秒后置70反应10分钟。2.4离心数秒后打开管盖，加110ul无水乙醇，盖上管盖，振荡混匀。下接步骤2.5（负压法）或2.12（离心法） 负压法 2.5将作好标记的核酸提取柱插入连接管后，固定在负压装置上，将步骤2.4中的所有液体移入核酸提取柱。 2.6开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。 2.7在每个核酸提取柱内加入500ul样品处理液B，开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。 2.8在每

44、个核酸提取柱内加入500ul样品处理液C，开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。 2.9取下核酸提取柱，将其放人2ml离心管中，14000rpm离心1分钟。 2.10将提取柱放入一新的2ml离心管中，小心将30ul灭菌纯化水加在柱面中央，静置1分钟。 2.11 l0000rpm离心1分钟，取2ml离心管中的收集液l2ul做PCR反应模板。 离心法 2.12将作好标记的核酸提取柱放入2ml离心管中，将步骤2.4中的所有液体移人核酸提取柱。 2.13 l0000rpm离心1分钟。 2.14将提取柱放入一新的2ml离心管中，加入500ul样品处理液B，l0000rpm离心1分钟。 2.15将提取柱

45、放入一新的2ml离心管中，加入500ul样品处理液C，l0000rpm离心1分钟。 2. 16将提取柱放入一新的2ml离心管中，14000rpm离心1分钟。 2.17将提取柱放入一新的2ml离心管中，小心将50ul灭菌纯化水】加在柱面中央，静置1分钟。 2.18 l0000rpm离心1分钟，取2ml离心管中的收集液12ul做PCR反应模板。f）收拾台面至准备状态。3.3 结核杆菌（痰液）a）取晨痰加入2倍体积4氢氧化钠待其充分液化(30分钟)，液化过程中，振荡23次，如痰液粘稠，可延长液化时间。b）取1 ml液化痰加入1.5ml离心管，15000转离心10分钟。c）弃上清留沉淀，加入1mlTE

46、液混匀，15000 转 10分钟离心，弃上清液。d）重复c操作，留沉淀，加入50l TB DNA提取液，振荡混匀。e）100度沸水浴15分钟，15000转离心10分钟备用f）取上清7l点样上机。3.4 沙眼衣原体和解脲支原体（分泌物）a）将取样后的拭子放入1.0ml的无菌生理盐水漂洗片刻，在试管壁上挤干后丢弃。b）吸取液体转至1.5ml离心管中，用于检测。c）用带滤芯吸液头吸取100l样品处理液A于0.5ml离心管中，再加入100l被测样本。d）盖上管盖，振荡混匀，13000rpm离心10分钟。e）吸弃上清，向沉淀中加入50l样品处理液B，振荡混匀低速（2000rpm）离心数秒后，100度干浴

47、或沸水浴10分钟。f）13000rpm离心10分钟，取2l上清为PCR反应模板。（上清液不立即使用，须置-20度保存，重新使用时需13000 rpm 离心10分钟。）检测结果分析的标准操作程序1.目的 保证扩增及结果分析的标准化、规范化；保证实验结果的有效性，准确判断实验失控的原因，加强实验的可靠程度。2.适用范围 本规则适用于实验结果判定标准3.制定依据临床基因扩增检验技术申子瑜李金明主编人民卫生出版社出版2002年第一版；试剂使用说明书4.职责 由经培训合格的临床基因扩增实验室技术人员负责操作。5.结果分析标准程序 5.1对于结果曲线的分析，应按以下步骤进行：全部曲线阴性对照阳性室内质控品

48、阳性标准品逐个分析（标出阳性标本和可疑标本）调整参数，获得较好的标准曲线，显示定量结果登记，发报告。5.2整体曲线的观察 将所有曲线选中进行整体观察观察是否存在污染情况（包括标本污染和试剂污染），特别应注意大量曲线在同一Ct值出现上涨的情况。观察是否有光路传导阻滞或电压波动等机器原因形成的异常曲线。5.3空白对照的分析空白对照：仅含扩增反应混合液的管作用：监测扩增试剂是否发生污染5.4阴性对照的分析阴性对照：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知阴性标本。作用：用以监测实验室和前处理过程中是否存在污染。5.5阳性对照的分析阳性对照：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知阳性标本。作用：用以监测

49、实验能否正常检出阳性标本，避免假阴性的出现。5.6阳性室内质控品的分析阳性室内质控品：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知浓度的阳性室内质控血清。作用：用以监控日常实验的精密度。5.7阳性标准品的分析5.7.1各梯度曲线的分布是否均匀，若各梯度曲线均未分开，则表明阳模稀释可能存在问题，提示实验中存在较大人为误差。5.7.2观察各曲线的Ct值是否在平常的正常位置。有两种情况：若出现低拷贝标准品做不出，而各曲线Ct 值均后移，则判断是否为试剂扩增效率下降（如试剂过期或保存条件不合格）。出现低拷贝标准品做不出，而高拷贝曲线Ct值均正常，则提示可能存在低拷贝阳性标准品的降解情况。5.7.3每日必做1

50、03标准品，用作以下三方面监控：1)是否存在操作误差，如加样量过少等原因导致103标准品未能检出；2)是否存在稀释后的梯度放置过久，低拷贝标准品降解的情况；3)是若高拷贝标准品出现Ct值后移，且能排除情况、则判断是否为试剂灵敏度下降。5.8单个曲线的判断逐个分析每条曲线，判断曲线的阴阳性或属可疑曲线。（可疑标本是指曲线在27个循环后Ct值出现上涨且平台趋势不明显或上涨幅度比较低的标本。可疑标本要第二天重做，两次结果一致则报阳性，否则结果报阴性。）5.9得出定量结果调节基线和阈值以得到较好的标准曲线。电脑据此曲线给出阳性结果值。此时应排除某些阴性标本因荧光曲线假性上扬而得出的假阳性结果和某些弱阳

51、性标本因终末荧光值过低而显示的假阴性。5.10发放报告：及时登记检测结果记录，发放临床报告。6.同批同次实验结果的判断程序6.1判断项目：每次实验要设置一个阴性对照、一个阳性对照、一个室内质控血清、一组阳性标准品（4个梯度107、106、105、104）。6.2实验结果无效的判断标准6.2.1阴性对照扩增增长。6.2.2阳性对照没有扩增增长。 6.2.3大批甚至所有的标本都扩增增长了。6.2.4室内质控血清检测结果出现失控情况，实验失控的具体标准详见室内质控标准操作程序。出现上述四种情况中的任何一种或多种，当日实验结果不可发报告，查找原因，重做实验，并做好记录。6.3 实验结果有效的判断标准6

52、.3.1阴性对照没有扩增增长，阳性对照扩增增长。6.3.2阳性标准品梯度曲线平滑均匀，斜率、截距和相关系数三个参数的数值均在范围内。6.3.3室内质控血清检测结果处于在控状态，具体标准详见室内质控标准操作程序。以上几项标准均达到要求后，当日实验有效，可以发放检验报告。7. 结果失控情况处理及原因分析7.1.失控情况处理如发现质控数据违背了控制规则，操作员应填写失控记录或失控报告单，上交专业室主管，由专业主管做出是否发出与失控质控品相关的那批患者标本检测报告的决定。7.2.失控原因分析失控信号的出现受多种原因的影响，这些原因包括：操作上的失误、仪器维护不良以及采用的质控规则、控制限范围、一次测定

53、的质控标本数不当等等。失控信号一旦出现就意味着与失控质控品相关的那批患者标本报告可能作废。此时，首先要尽量查明引起失控的原因，如假失控，可由权威人士决定、签字后发出报告。如是真失控，最好是纠正原因后，全部标本重做，质控品测定合格后再签发字发出。当得到失控信号时，考虑采用如下步骤去寻找原因：1)立即重测定同一质控品 此步骤是用以查明是否为人误差或偶然误差，如是偶然误差，则重测的结果应在允许范围内(在控)。如果重测结果仍不在允许范围，应进行下一步操作。2)打开一 瓶新质控品，重测失控项目 如果新开的质控血清结果正常，那麽原因的质控血清可能过期或在室温放置时间过长而变质，或被污染。如果结果仍不在允许

54、范围，则进行下一步骤。3)检查仪器状态、清洁扩增槽。如不行，进行下一步。4)检查试剂 此时可更换试剂以查明原因，如不是试剂问题，进行下一步。5)请专家或公司工程师帮助 如前面四步都未能得到在控结果，可能是仪器出现了较大故障，应同仪器厂家联系请求他们的技术支援。检测结果报告程序1. 目的：为使报告的生成、发放、管理受控，特制订本程序，确保检测报告的准确、清晰。2. 适用范围：本程序适用于本基因扩增检验实验室所有临床检测项目的结果报告。3. 职责：只有经PCR培训并获得上岗证的工作人员才有权审核和签发报告单。4. 工作程序：4.1 检测结果的报告应准确、清晰、明确、客观和及时，杜绝虚假报告。4.2

55、 实时荧光PCR测定的数据要经分析，避免因非特异性荧光而造成假阳性结果。根据质控品判断PCR扩增的有效性，只有当质控品的扩增结果符合项目SOP有关条件时，才可发出报告，否则应重新测定。4.3 定性测定的检测项目其结果以 “阴性”或“阳性” 报告；定量测定的，结果报告以每毫升拷贝数（拷贝/ml），如结果高于测定方法线性范围上限，则对样本稀释后再测，结果乘上稀释倍数；如结果低于方法的测定范围下限，则报告多少即可，不能报告为“0”或“阴性”。4.4病人档案及测定结果一并录入“检验管理系统”，由电脑管理病人资料。报告内容至少应包括：病人姓名、性别、年龄、及测定项目、结果、参考范围以及样本号、标本类型、检测日期、实验操作者和审核者的签名、报告日期等。否则视为无效或虚假报告单。4.5报告单应及时发出。门诊病人报告单送至服务台门诊报告发放处，病区报告单由专人送至各病区。4.6 当临床科室要求电话报告结果时，应先确认对方身份，核对其所查询的病人姓名、病区床号等情况，方可报告，并明确告知对方，实验的最终结果以检测报告单为准。4.7 当患者要求电话