转录组实战讲解第三讲之测序质量评估和reads回贴ppt课件

1、.,长非编码RNA测序分析实战讲解之测序质量评估和Reads回贴,卜德超 budechao 中国科学院计算技术研究所 2014-12-20,.,概要,长非编码RNA测序介绍 一个测序实例 长非编码RNA分析流程 步骤一详解：Reads质量评估 步骤二详解：基因组比对 附录：运行命令,.,长非编码RNA测序介绍 一个测序实例 长非编码RNA分析流程 步骤一详解：Reads质量评估 步骤二详解：基因组比对 附录：运行命令,.,长非编码RNA测序,长非编码RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一类长度大于200 nt且不编码蛋白质的RNAs 长非编码RNA测序：通过测

2、序技术，获得某个物种或特定细胞在某一生理条件下产生的所有的长非编码RNA,.,想测长非编码RNA，提取RNA的步骤是怎样的？,.,转录组内的RNA,转录组RNA，按功能分类： mRNA 非编码RNA（即Non-coding RNA，如 tRNA，rRNAs，microRNAs，piRNAs 和lncRNAs等） 转录组内的RNA, 按polyA形态： 带polyA的RNA (mRNA和大部分的lncRNA) 不带polyA的RNA (小RNA和小部分的lncRNA),.,长非编码RNA测序,总的RNA(200),去掉rRNA后的RNA,不带polyA的RNA,带polyA的RNA,polyA富

3、集,总的RNA(200),去掉rRNA后的RNA,测序(mRNA+lncRNA),测序(lncRNA),mRNA测序(mRNA+lncRNA),方案二,方案一,.,长非编码RNA测序介绍 一个测序实例 长非编码RNA分析流程 步骤一详解：Reads质量评估 步骤二详解：基因组比对 附录：运行命令,.,9,一个测序实例,取样：晚期肝癌病人的肝组织(共4个) 癌旁组织(N) 原发灶(P) 转移灶(M) 门脉血栓转移灶(V),一组时间序列上的4个点的取样,.,RNA提取和测序参数,RNA提取 提取带有polyA的所有RNA 测序 Illumina Hiseq 2000测序 文库插入片段长300 双端

4、测序 reads长度为100 D-UTP链特异性文库,.,长非编码RNA测序介绍 一个测序实例 长非编码RNA分析流程 步骤一详解：Reads质量评估 步骤二详解：基因组比对 附录：运行命令,.,12,转录组分析的通用套路,定量,鉴定,差异,功能,有多少RNA,RNA的表达量,结构、表达量、比例的变化,功能注释,.,测序数据,和参考基因组比对,测序评估及低质量过滤,编码基因表达注释,转录本重构,长非编码鉴定,长非编码表达注释,编码基因差异(特异)表达,GO功能显著性富集,Pathway显著性富集,功能富集网络图,长非编码差异表达,GO功能显著性富集,Pathway显著性富集,功能富集网络图,F

5、usions,Junctions,Genome Browser可视化,这一堂课关注内容,.,长非编码RNA测序介绍 一个测序实例 长非编码RNA分析流程 步骤一详解：Reads质量评估 步骤二详解：基因组比对 附录：运行命令,.,测序下机数据,测序输出的两个文件(双端测序数据)： N_R1.fastq HWI-EAS724_0001:8:32:374:374#0/1 GAGCTGTATATGAATAATAGTTCGTTTTTCATTATCCAAGATGGATCGGTATAAAGTCTGCTAAAATAAAGGTACAACG +HWI-EAS724_0001:8:32:374:374#0/1 f

6、cfcfggdfggggfggggcggggggggfgggggcgggfWgggggggggfgcggdgcgcggggfacbbbbgcgggggd N_R2.fastq HWI-EAS724_0001:8:32:374:374#0/2 TACCGTTAATAGCAGTAATATCATAATAGTAATAGCATCATAACGGTAGTCCCATAAAAGTGTGTCAGTAGTAGTAGTA +HWI-EAS724_0001:8:32:374:374#0/2 ggggfgggggd_adcggggeggfggeggegfgeececdegggggfegcfegggegggfgacaced

7、bd_cYb,拿到共4对这样的测序文件,.,Fastq文件质量值表示,N_R1.fastq HWI-EAS724_0001:8:32:374:374#0/1 GAGCTGTATATGAATAATAGTTCGTTTTTCATTATCCAAGATGGATCGGTATAAAGTCTGCTAAAATAAAGGTACAACG +HWI-EAS724_0001:8:32:374:374#0/1 fcfcfggdfggggfggggcggggggggfgggggcgggfWgggggggggfgcggdgcgcggggfacbbbbgcgggggd,用字符来表示每个碱基的质量值,.,字符值-如何计算Q值,对

8、应的就是Q30,ASCII码表,.,Q-score,.,ASCII码、Q-score与错误率计算,Ascii码与Quality Score： Sanger: Q=ASCII值-33 Illumina1.3之后：Q=ASCII值-64 Quality Score与错误率：,.,20,测序质量评估,工具 fastQC（推荐） fastX-Tookit,注意adpter或是barcode的存在,.,长非编码RNA测序介绍 一个测序实例 长非编码RNA分析流程 步骤一详解：Reads质量评估 步骤二详解：基因组比对 附录：运行命令,.,22,和参考基因组比对,转录组比对工具选择： Tophat,Map

9、ping and discovering splicing junctions with RNA-seq,.,几种常见比对工具对比,输入：RNA-seq data,.,双比对策略,基因组-转录组双比对策略： Bowtie比对到已知编码基因集合(转录组) Tophat比对到基因组(基因组),思考：为何比对转录组？,.,比对结果统计,.,26,比对结果解读,若双端中有一端比对率高，一端比对率很低，则类同第四种情况,?,?,?,?,.,27,Tophat回贴原理,Reads,Mapped to the genome,Unmapped,Split and Mapped,Searching the sp

10、licing site,.,Junctions和Fusions鉴定,Tophat比对后的输出目录： Junctions.bed Insertions.bed Deletions.bed Tophat-fusion：Fusions鉴定工具,Tophat直接报出junctions结果,Tophatfusion:从tophat的输出挖掘fusions,.,长非编码RNA测序介绍 一个测序实例 长非编码RNA分析流程 步骤一详解：Reads质量评估 步骤二详解：基因组比对 附录：运行命令,.,运行命令汇总(一),fastqc o QC_outdir_N N_R1.fastq N_R2.fastq,1,

11、 质量评估：,fastqc o QC_outdir_P P_R1.fastq P_R2.fastq,fastqc o QC_outdir_M M_R1.fastq M_R2.fastq,fastqc o QC_outdir_V V_R1.fastq V_R2.fastq,.,运行命令汇总(二),tophat o tophat_outdir_N -library-type fr-firststrand -fusion-search hg19 N_R1.fastq N_R2.fastq,2, 比对基因组：,tophat o tophat outdir _P -library-type fr-fir

12、ststrand -fusion-search hg19 P_R1.fastq P_R2.fastq,tophat o tophat_outdir_M -library-type fr-firststrand -fusion-search hg19 M_R1.fastq M_R2.fastq,tophat o tophat_outdir_V -library-type fr-firststrand -fusion-search hg19 V_R1.fastq V_R2.fastq,hg19为基因组的bowtie2的index文件,.,运行命令汇总(三),bowtie o bwt_outdir_

13、N refgene -1 N_R1.fastq -2 N_R2.fastq -S N.sam,3, 比对转录组：,bowtie o bwt_outdir _P refgene -1 P_R1.fastq -2 P_R2.fastq -S P.sam,bowtie o bwt_outdir_M refgene -1 M_R1.fastq -2 M_R2.fastq -S M.sam,bowtie o bwt_outdir_V refgene -1 V_R1.fastq -2 V_R2.fastq -V P.sam,refgene为bowtie产生的index文件,.,运行命令汇总(三),tophat-fusion-post hg19,4, Fusions鉴定：,在toph