侦测食品中之微生物

1、Detecting MO in FoodsAims1. To understand the traditional methods and rapid methods for detecting microorganisms in foods2. To understand the principles, advantages, limits, and application for each detecting method3. To understand the issues of the metabolically injured microorganisms (MO) and the

2、viable but non-cultivable MO (VBNC) Outline1. Homogenization methods2. Standard plate count (SPC)3. Spiral plate count4. Membrane filtration methods5. Microscope plate count6. Petrifilm7. MPN8. Direct microscopic count9. Dye reduction test10. Detecting MO on surfaces11. Metabolically injured microor

3、ganisms12. Viable but non-cultivable microorganisms (VBNC) 13. Phisical, chemical, molecular, and immunological methods 均質法（Homogenization methods）Waring Blendor vs. StomacherWaring Blendor 為廣泛使用方法(除了有刺、尖銳之食品外)， 優點：1.免於清洗、殺菌操作2. 正常操作時間內（2 min）不生熱，不影響菌數3. 噪音低4. 均質液易貯藏5.不會引起食品組織（細胞）之高度破碎，容易吸取樣品，而且，降低來

4、自食品組成份之干擾（尤其在非SPC偵測法）9-1 標準平板法Standard Plate Count (SPC)，活菌數1. 計數：25 250 cfu（或30 300 cfu）2. 假設：(1) 各培養皿中之菌落源自單一菌體。(2) 所提供之條件（營養、溫度等）足以使食物中所有菌生長，而產生菌落。3. 方法：(1) 混稀法（pour plate count）(2) 塗抹法（spread plate count, surface plate count）塗抹法優缺點（與混稀法比較）(a)無熱傷害 (b) 有利好氧菌快速生長 (c) 容易計數 (d) 可自動化操作 (e) 菌落易分離 螺旋平板法

5、（Spiral plate count）1.所用培養基、平板、稀釋液、吸管均較少2.快速，50 60 plate/h3. 易受食物顆粒阻塞5. 設備費用高9-2 膜濾法（Membrane filtration methods）l 適用於水、飲料、或空氣等菌數低者l 可能需預濾，以去除食物顆粒，或添加酵素、介面活性劑等以利過濾1. 直接螢光過濾法（Direct Epifluorescent Filter Technique，DEFT）留於濾膜上之菌株，以螢光染劑，如acridine orange染色，再以螢光顯微鏡計數操作：Food homogenate5 m nylon filterfiltr

6、ate, 2 ml Triton X-100 & 0.5 ml Trypsin0.6 m Nucleopore polycarbonate filterfilter stained with acrine orangecount2. Microcolony - DEFTFiltrationl Microcolony method：Sample filter plate, incubate for 3 6 h microscopic countl Microcolony - DEFT method：( nucleopore membrane)Sample filter plate, and in

7、cubated acridine orange stain fluorescence microscopic count9-33. 疏水性格膜過濾法（Hydrophobic Grid Membrane Filtration, HGMF）(1) 1600 wax grid/membrane(2) 減少稀釋操作(3) 已有分析項目total coliformsfecal coliformsSalmonellaeE. coli O157: H7 顯微鏡菌落計數（Microscope colony counts）0.1 ml sample 2 ml nutrient agar mix spread o

8、ver a 4 cm2 area on a glass slide incubated 3 8 h in a warm moist chamber air dried, flame-fixed, stain for count with microscope. Petrifilm1. 將培養基塗敷於數層纖維所構成之薄膜上2. 攜帶儲存方便3. 可用於表面微生物分析 最可能菌數法Most Probable Number（MPN），活菌數1. 3 - tube or 5 - tube2. at least 3 serious dilutions are used3. monitored by tu

9、rbidity, color change, or gas production4. estimated data, less precise than agar plating methods5. used for low cell counts9-4 染劑還原法（Dye Reduction Tests），活菌數1. 原理：菌體具reductase，當菌體代謝時，故使培養液還原所需時間與菌數成反比。2. 還原指示劑：methylene blue：從藍色變成無色resazurin：二段式，(1)從藍紫粉紅，不因O2存在而又變成藍；(2) 從粉紅變無色，可因O2存在又氧化成粉紅。3.特性(1)比

10、SPC快(2)估測值(3)非所有MO.還原能力（速度）相同(4)指示劑可能對部分MO.有抑制作用(5)食品本身可能亦含還原劑或酵素而干擾直接鏡檢Direct Microscopic Counts（DMC），活、死菌1. 操作(1)取0.01 ml均質液平均塗抹於1 cm2面積之載玻片上(2)固定（40-50）、乾燥(3)染色(4)油鏡下計數2. 優點(1)快速；(2) 簡單；(3) 不需其他設備；(4) 觀看菌體形狀；(5) 樣品量極少。9-53. 缺點(1)死、活不分；(2) 僅適用於高菌含量樣品；(3) 觀察者易疲勞；(4)菌體可能成團，分散不均，或有些不易染色。現已有方法區分死、活菌體

11、Howard Mold Count1911年由B. J. Howard開發，分析蕃茄製品中黴菌，另外，機械黴Geotrichum candidum亦相似，均利用有凹槽載玻片，在顯微鏡下，計數食品中所含黴菌菌絲，需有經驗者方能操作，且易疲勞。 表面微生物檢驗生物體表加工機械、器皿、工作台1. Swab / Swab-Rinse Method最早、最廣泛使用者以棉花棒（濕）塗抹固定面積之物體表面，再將之放入含無菌水之試管內，均質，稀釋，平板法計數，若配合ATP分析法，塗抹後，可迅速得知結果，常用於清洗效果之評估用。9-62. 接觸平板法（Contact plate）以特殊雙重皿，導入15.5-16

12、.5 ml之培養基，產生凸起洋菜培養基表面，將之覆蓋於欲測物面，加蓋培養，計數菌落數。回收率不高，有人云僅0.1，即若測得10 cfu/cm2，實際含量為104 cfu/cm2。亦有人實驗顯示回收率低於塗抹法（Swab method），較適用於低污染物表面。3. 噴槍法（Spray gun）以高壓水沖洗物體表面，再分析洗液中菌數。對肉品表面菌數分析，此法優於塗抹法。 代謝性受傷之微生物（Metabolically injured organisms）微生物受次死環境侵害，影響其代謝（但未死亡），故在選擇性培養基上無法生長，但可在非選擇性培養基生長，故可將樣品分別選擇性及非選擇性培養基分析之，二

13、者之差，即為Injured MO.。食品病原菌之檢測管制，常為不得檢出，測試樣品由於曾經凍藏、或加熱等處理，可能含有受傷之病原菌（未死），故通常需將樣品均質液放在適當非選擇性培養液中短暫時間（14 h），使受傷菌復原，再以選擇性培養基分析之。由部分研究顯示，培養液中含丙酮酸或催化等有助於受傷菌復原，此二物質之功能均為分解過氧化物，故推測受傷菌可能缺乏去除過氧化物之能力。MO.代謝性傷害可能發生在細胞膜（脂質）、核醣體、DNA、或某些酵素。9-7不能培養的活菌（Viable but non-cultivable organisms, VBNC）VBNC與代謝傷害性菌不同，後者可於非選擇性培養基修

14、護。VBNC首被發現於海洋弧菌，當海水溫度被降至5，弧菌成為VBNC狀態。此時，plate count者很低，但由以acridine orange之鏡檢法（可區分死、活），菌數卻非常高。當溫度升高，VBNC即可恢復原來狀態，處於VBNC之病菌，仍具致病力，僅毒性較低。9-8 物理、化學、分子及免疫分析法A. 物理方法1. 電阻抗或導電度法（Impedance/Conductance Method）(1)原理：微生物生長時，要利用（分解）環境中成份，因此改變環境（培養液）中電阻抗/導電度。(2) 固定儀器，有其偵測之靈敏度。(3) 儀器感應出電阻抗/導電度變化所需時間（Detection tim

15、e）與菌體數成反比。(4) 由已知菌數樣品進行標準曲線之制訂，再用以分析未知菌數。(5) Vitek公司之Bactometer測電阻抗；Malthus公司則偵測導電度。2. 流電細胞計數法（flow cytometry）原用魚動物細胞測定，現可用於酵母菌計數，若配合螢光抗體，可測特定細菌。B.化學方法1. Thermostable nuclease(1) 金黃葡萄球菌具coagulase及therostable nuclease，二者相關性高，故藉由食品中Thermostable nuclease活性高低，得知S. aureus多少。然部分enterococcus亦具nuclease活性，且少

16、部分為thernostable nuclease（4.3）。9-9(2) 分析thermostable nuclease以代表S. aureus生長狀況之優點：(a)耐熱性，即使菌體因熱死亡，nuclease仍在，而S. aureus所產之腸毒素亦屬熱安定性。(b)偵測比腸毒素快。(c)比腸毒素早產生。(d)不需濃縮即可偵測，腸毒素需濃縮。(e) 二者均為熱安定性。2. Limulus lysate for endotoxinsG()之outermembrane之lipopolysaccharide（LPS） endotoxinLimulus polyphemous之amoebocyte（血球

17、細胞）裂解物蛋白對endotoxin極敏感（活化），使得lysate呈膠狀，早期分析法乃偵測可使lysate成gel之最大食品稀釋度（即為力價數，titer），為半定量法。近來，發展出呈色法，加入試劑（如 gly(ala)-arg-nitroalanine（NA），當樣品中有LPS，可使coagulase活化，其可將NA水解，產生-nitroalanine，測405 nm吸光值。EndotoxinFactor CFactor C*Factor BFactor B*(coagulase)(coagulase*)Proclotting enzymeClotting enzyme*：活化狀態Coag

18、ulogenCoagulin9-10NA : -nitroalanine3. ATP測定活細胞均有ATP且細胞內ATP含量恆定，以菌量而言，含量約1018 1017 mole/cell，將菌體內之ATP萃取出來，分析其ATP含量，即間接代表菌數多寡。Mg2利用螢火蟲發光機制，來分析ATP：LH2EATPELH2AMPPPiELH2AMPO2ELOCO2AMPLightLH2：luciferinE：luciferaseLO：oxyluciferinPPi：pyrophosphate9-11此法非常快速，可用在工廠清洗效率評估之快速偵測用。若應用在食品上，需克服來自食品之ATP干擾，可利用離心、過

19、濾等物理方除去食品顆粒，或添加酵素apyrase，選擇性地破壞食品ATP。4.螢光性及發光性基質之應用常用基質：4-methlumbelliferyl-D-glucuronide（MUG）4-methlumbelliferyl-D-galactoside（MUGal）4-bromo-4-chloro-3-Indolyl-D-glucuronide（X-Gluc）o-nitrophenyl-D-galactopyranoside（ONPG）5-bromo-4-chloro-3-Indoxyl-D-glucuronide（BCIG）L-alanine-P-nitroanilied（LAPN）其中以

20、MUG之螢光性基質最常用，其可被-D-glucuronidase（GUD）水解，釋放出具螢光之4-methyl-umbellifery group，E. coli具有GUD，故可用於E. coli檢驗，將MUG加入大腸桿菌群分析用之選擇性培養基中，如lauryl tryptose broth（LTB），有E. coli者，會產生螢光，約107 cell之E. coli產生之GUD才足夠偵測到MUG結果。ONPG亦同樣利用，經-D-galactosidase水解後，產生黃色（420 nm吸光），用已偵測Coliforms。若NPG及MUG同時當作唯一營養基質，coliforms呈黃色菌落，黃色菌

21、落同時有螢光者為E. coli。9-125. Lux基因之發光Lux基因負責luciferase之合成，將lux gene轉殖到噬菌體，在噬菌體本身，因缺發光所需之成分，無法發光，利用噬菌體對細菌記主之專一性，其基因進入細菌後，發光。可用以分析特定細菌（病原菌）。C核酸探針/PCR尋找預測微生物特有的核酸片段，將之標示，此即為核酸探針。當此probe碰到與其互補序列，會結合（or雜交，hybridization），由probe之標示物，我們可偵測之。典型分析法：預測cell 抽取DNA 內切水解 電泳 轉至NC membrane 加probe行hybridization 清洗 偵測，偵測敏感度

22、：104105，若低於此，樣品先經enrichment，使少量菌增殖，再偵測之。另外，發展菌落雜交法（colony hybridization），乃樣品均質 選擇性培養基培養，其上菌落複製至membrane上，在加reagent，使菌溶製（lysis），使DNA露出，成單股，加probe偵測之。近年來，伴隨PCR（polymerase chain reaction）之放大技術，使食品中存在之少數菌之DNA，在人為操控環境下進行複製。Primer, DNA polymerase, dATP，dGTP，dCTP，dGTP9-13經過多次循環（2050 cycles），可使單一DNA分子擴增至107

23、DNA分子，如此，樣品中即使僅1個cell，也可以測到。1. 核酸探針的優點和缺點(1) 核酸探針的優點：(a)核酸探針不必單離、純化菌株，可節省不少的時間與成本。(b) 核酸探針可以快速鑑定、計數與之雜交的菌株。(c)特異性高，其受微生物其基因突變或細胞內的控制影響較少。(d) 對於有機溶劑、鹽的容忍度而言，DNA的穩定度比蛋白質為高。(e)靈敏度高。(2) 核酸探針的缺點：(a) 利用32P-labeled核酸探針，其t1/2 = 14天(b)核酸探針不能探知食品中已經存在的毒素。(3) 核酸探針的一般特性：(a) Target nucleic acid的選擇（Wolcott, 1991）

24、選擇Target nucleic acid 可由下列四方面著手：(i)為genomic DNA，物種會含隨某些特殊的基因片段，故其特異性甚高。(ii)為messenger RNA (mRNA)，在生物體內mRNA的量比genomic DNA高出很多，所以比較容易被偵測。(iii)為rRNA，這是最有用的核酸探針來源，它同時具有用genomic DNA和mRNA為探針的點。最後核酸探針的來可由plasmid DNA所獲得，菌產生毒素的基因可能在plasmid DNA上，故可藉此作核酸探針。9-14(b)探針的大小 探針的大小可從10 nucleotide bases（M.W. 3,300）至10,000 base（M.W. 3,300,000），然而最常見的核酸探針在14至40 base之間。核酸探針可依其核酸探針的片段長度區分成短鏈探針和長鏈探針。短鏈探針，其雜交的度比較快，但是專一性較差且很難被label上去。(c)核酸探針的label核酸探針label的方法計有（Veld et al., 1988）a. r