兰花组织培养.ppt

1、a,1,兰花的组织培养,刘迪,a,2,兰花 （学名：Orchidaceae），属兰科，是单子叶、多年生草本植物，亦叫胡姬花。古今名人对它评价极高，被喻为花中君子，是中国十大名花之一。兰花的品种有很多，据不完全统计，全世界有2万多个品种，其中比较出名的有蝴蝶兰、春兰、寒兰、蕙兰等。 花语：淡泊、高雅，美好、高洁、贤德,a,3,a,4,a,5,一、兰花无性快速繁殖 二、 快速繁殖的影响因素 三、兰花脱毒植株的鉴定,a,6,一、兰花无性快速繁殖 原球茎发生体系是兰花唯一有效的大规模无性繁殖方法。该方法是1960年法国学者G.Morel开创的，促使了兰花工业的形成，获得巨大的经济效益。 （一）培养程序

2、 外植体 诱导形成原球茎 原球茎大量增殖 分化为小植株 生根壮苗培养 温室栽培 室外栽培 （二）取材和处理 兰花茎尖、叶片、花器官、种子等都可作为外植体进行培养，诱导再生植株。茎尖是细胞分裂最活跃的部分，是较容易诱导，培养成功率高的部位。在兰花茎尖培养时，首先从生长健壮的植株上切取10cm长的茎尖，去掉苞叶，用加有适量洗涤剂的自来水洗净，在超净工作台上用75酒精消毒数秒，无菌水冲洗45次，再用5漂白粉消毒约10min或用45min，无菌水冲洗45次后备用。在叶片培养中，应选择带有嫩叶的花梗。,a,7,（三）接种和培养 1. 接种：茎尖，在超净工作台上，借助体视显微镜，用镊子将消毒茎段的幼叶剥下

3、，露出生长点后，用解剖刀切取0.50.8mm大小的芽（应尽量小，以利于脱毒），接种于培养基上 。叶片，从茎段切下的幼叶连同花梗的幼叶一起，在无菌的条件下切割成0.30.5的小片，接种到培养基上。 2. 培养基：诱导兰花茎尖形成原球茎的培养基为，MS或B50.51.0mg/LNAA1.0mg/L6-BA10椰汁；诱导叶片形成原球茎的培养基：改良KyotoNAA0.1g/mL6-BA1.0mg/L肌醇100g/mL烟酸0.1g/mL维生素B10.05mg/L腺嘌呤20mg/L蔗糖2尿素0.2 原球茎生成芽的培养基组分：需降低无机盐浓度，一般采用1/31/2MS或3/44/5B5，其余成分与诱导原球

4、茎形成的培养基相同。,a,8,3.原球茎的诱导培养 茎尖生长点或叶片接种在原球茎诱导培养基上。茎尖经过23周的培养，生长点开始呈绿色。茎叶先开始生长，然后生长点组织的基部开始肥大，形成原球茎，约30d即可见原球茎形成。（培养温度一般低于23。光强15002000lx）（培养基的选择、褐变） 4.原球茎的增殖培养 形成的原球茎可以不断分割，进行增殖培养，加速其繁殖，直到获得所需的数量为止。继代培养所用的培养基同诱导培养，可采用固体培养或液体培养，培养条件也一样。原球茎的生长大致有四种类型： 极易增殖型；原球茎增殖较慢，但易分化成苗。分割的原球茎接种后停止生长；转接后不枯死经几周变褐后又形成小的原

5、球茎。对极易增殖型应缩短培养周期，增加转代次数，加快繁殖可用液体震荡培养使其形成大量新的生长点，然后再分割接种在固体或液体的培养基上，进行繁殖。,a,9,对原球茎增长较慢的类型，应改变培养基配方，特别应降低离子浓度。其他类型的材料则应弃掉。原球茎增殖的初期，分割极易产生褐色物质，初次分割出的原球茎，应在离子浓度较低的培养基中培养。 5. 苗的分化培养 增殖的原球茎不一定都能顺利分化成苗，不同品种之间差异很大。兰科植物不易受生长调节物质的影响。因此不能简单地通过改变激素浓度的方法来诱导再生植株，兰属植物一般是将原球茎转入离子浓度较低的培养基中，培养基组成同诱导培养，再加入一些椰子汁等天然提取物质

6、，原球茎会很快再生成植株。 6. 苗的生长培养 较大的兰花个体才便于移栽，新形成的小苗必须移入较大的培养容器内，生长到 一定大小时才能移栽，一般是将1cm的幼苗转移到壮苗培养基上培养到10cm米高，方可移栽。,a,10,这个阶段幼苗的生长代谢都比较稳定，培养基成分可简单些，但培养基离子浓度不能过高，否则会出现小老苗或畸形苗。 7.幼苗移栽 从培养瓶中取出带有34片叶、34条根310cm高的组培苗，将根部培养基洗净，移植到泥炭或蛭石中（该基质材料保湿又透气），保持弱光，注意保湿，并定期浇水施肥，以促进生长。,a,11,二、快速繁殖的影响因素 （一） 培养基 兰花组培使用的培养基有10余种。基本培

7、养基选择需考虑的关键问题是离子浓度，一般应用较低的离子浓度，且不同的培养阶段要求的离子浓度不同。培养基中可添加生长调节物质、生物活性物质，氨基酸、天然提取物等。 （二） 材料褐变 防止材料褐变是兰花组培成功的关键，褐变的主要原因是材料从伤口分泌出酚类化合物，酚类物质在多酚氧化酶的作用下转变为醌类物质而引起褐变，醌类物质在络氨酸酶的作用下与培养材料组织中的蛋白质发生聚合，引起其他酶系统失活，导致代谢紊乱，生长受阻。,a,12,（三）原球茎的苗分化 兰花初代培养形成的原球茎一般可分化成苗，但有些种往往不分化成苗，或者产生畸形。除品种差异外，培养条件也很关键，可向培养基中添加香蕉汁、椰子汁等 植物组

8、织提取物。或添加一定浓度的IAA、NAA，或降低培养基的离子浓度加以调整。 （四）变异 兰花组织培养中的变异主要与高浓度激素、长期继代培养、主芽部位和大小、自身芽变等有关。前三者可以在培养中加以改善和防止，后者是无法避免的。所以要慎重选择外植体，培养基和培养条件。在继代和扩繁过程中应及时淘汰变异材料。如利用核酸分子检测技术检测再生植株，快速检测其变异情况。,a,13,三、兰花脱毒植株的鉴定 目前，国内外检测兰花病毒主要采用生物学检测、电镜检测、血清学检测和分子生物学检测等方法。例如：三抗夹心酶联免疫吸附法（three antibodies sandwich-ELISA TAS-ELISA)检测建兰花叶病毒（CymMV）、双抗夹心酶联免疫吸附法(double