基因转录调控相关文献讨论课汇报

1、1,Speaker : xxx,Institution : xxx,Cancer-Specific Retargeting of BAF Complexes by a Prion-like Domain,Method :,2,3,4,构建包装质粒和转移质粒 包装质粒和转移质粒共转染HEK293T细胞 培养 48-72小时，收集培养液，离心浓缩 转染目标细胞 检验敲除或过表达效率： mRNA 水平：RT-qPCR 蛋白质水平：Western blot,5,Gene delivery vector and packaging vectors pspax2 and pMD2.G :,Gene del

2、ivery vector and packaging vectors GAG/POL and VSV plasmids :,Method : PEI 转染,Method : LT1 转染,6,7,8,由于本文中研究的EWSR1、FLI1、EWS-FLI1、BAF复合体等定位于细胞核，所以体外实验需要抽提核蛋白,9,（1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂）免疫沉淀，冰上或者4裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清； （2） 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1g相应的抗体和10-50 l protein A/G-beads加入到细胞裂

3、解液，4C缓慢摇晃孵育过夜； （3）免疫沉淀反应后，在4C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15l的2SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟； （4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。,10,Urea Denaturation Studies,Density Sedimentation Analyses,用于检验EWSR1和EWS-FLI1是否是BAF复合体的核心成分,用于检验EWSR1和EWS-FLI1是否是BAF复合体的核

4、心成分,浓度范围：0.25 to 2.5 M urea ； 使用尿素浓度梯度处理，比较EWSR1与BAF复合体相互作用减弱的尿素浓度,11,（1）甲醛交联整个细胞系（组织），即将目标蛋白与染色质连结起来； （2）分离基因组DNA，并用超声波将其打断成一定长度的小片段； （3）添加与目标蛋白质特异的抗体，该抗体与目标蛋白形成免疫沉淀免疫结合复合体； （4）去交联，纯化DNA即得到染色质免疫沉淀的DNA样本，准备测序； （5）将准备好的样本进行深度测序。,12,13,(B),14,ChIP-seq vs ATAC-seq,15,1. Biotinylated isoxazole-Mediated Precipitation,2. Protein purification and sedimentation assays,3. Confocal imaging of immunofluorescence,可沉淀具有低复杂性结构域的蛋白质，如EWSR1。 研究融合蛋白EWSR1Z-FLI1在有生物素化异恶唑时的沉淀情况,大肠杆菌体外表达GST-EWSR1-FLI1及GST-FLI1，再研究各自的沉淀情况,比较MSCs中V5-EWS-FLI1和V5-FLI1的点的形状,16