高压液相色谱HPLC培训教程(一)

1、高压液相色谱HPLC培训班(一)一.概论一、液相色谱理论的发展色谱的分离原理是，溶于流动相(移动相)的各组在通过固定相时，与固定相(吸附、分配、离子吸引、排除、亲和力)作用的大小、强度不同，因此在固定相的停留时间不同，所以从固定相依次流出。颜色层方法，也称为色谱。色谱是在1906年俄罗斯植物学家茨韦特研究用碳酸钙分离植物色素时发现的。后来，在此基础上，开发了纸色谱、薄层色谱、气相色谱、液相色谱。液相色谱的开始阶段是使用直径较大的玻璃管柱，将流动相从室温和大气压传递到液体水平差异(通常持续数小时的低热效率)。高效液相色谱(high performance liquid chromatograph

2、y，HPLC)在经典液相色谱的基础上，于60年代末引入了气相色谱理论，得到了快速发展。与经典液相色谱不同，具有高热效果的小而均匀的填充物粒子必须引起高电阻，以高压输送流动相，因此也称为高压液相色谱(HPLC)。由于分析速度快，也称为快速液相色谱(HSLP)。也称为现代液相色谱。二、HPLC的特点和优点HPLC具有以下特征：高压-最大150300Kg/cm2的压力。每柱米的血压为75 Kg/cm2以上。快速-流速为0.1至10.0 ml/min。效率-每米5000托盘。从一根柱子上可以同时分离出100种成分。高灵敏度-紫外线探测器灵敏度最高为0.01ng。同时少消耗样品。与经典液相色谱相比，HP

3、LC具有以下优点：快速-通常在15-30分钟内分析一个样品，部分样品也可以在5分钟内完成。高分辨率-您可以选择固定相和流动相以获得最佳分离效果。高灵敏度-紫外线检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。柱是可重复使用的-可以用一列分隔不同的化合物。样品量小，易于回收-样品经过加热后不会受损，可以收集或制造单个成分。三、色谱分类两相物理状态可以分为气相色谱(GC)和液相色谱(LC)。气相色谱法适用于挥发性化合物的分离。GC可以根据固定相分为气固色谱(GSC)和气液色谱(GLC)，其中GLC应用最广泛。液相色谱适用于低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质的分离。LC也可以分为液固色谱

4、(LSC)和液相色谱(LLC)。此外，以超临界流体(气体和液体之间的物质相)为流动相(通常为CO2)的超临界流体色谱(SFC)，由于扩散系数大，可以迅速达到平衡，因此分析时间短，特别适合手性化合物的分解。原理分为吸附色谱(AC)、分配色谱(DC)、离子交换色谱(IEC)、排除色谱(EC)、分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱(GPC)和亲和层析根据工作形式，可分为纸色谱(PC)、TLC (TLC)和柱色谱。四、色谱分离原理高效液相色谱根据分离机制分为液固吸附色谱、液相分配色谱(正负)、离子交换色谱、离子对色谱和分子排斥色谱。液固色谱使用固体吸附剂，分离成分在柱中分离原理根据固定相对成分吸附

5、力的大小分离。分离过程是吸附-分解吸附的平衡过程。常用吸附剂为二氧化硅或氧化铝，粒度为510m。适用于分子量2001000的分离，大部分用于非离子型化合物，离子型化合物容易产生抹布。常用于分离同分异构体。液-液相色谱如果将特定液体物质涂抹在熊表面，或使用通过将化学键结合在汤姆表面而形成的固定相，分离原理将根据移动相和固定相溶解度不同而不同地分离。分离过程是分配平衡过程。涂层固定对应惰性；必须事先提供固定相饱和的移动相，才能减少支撑体表面的固定相损失。温度的变化和不同批号流动上的差异常常引起柱子的变化。另外，流动上存在的固定相也使样品的分离和收集变得复杂。涂层固定床很难避免固定液的消失，目前很少

6、采用。现在使用了很多化学键固定相，如C18，C8，氨基柱，氰柱，苯基柱。液相色谱可以根据固定相和移动相的极性分为正气相色谱(NPC)和反相色谱(RPC)。正常色谱极性固定相(例如聚乙二醇、氨基和腈结合相)；流动相是相对非极性疏水溶剂(正己烷、环己烷等烷烃)，经常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等，调节成分保留时间。经常用于分离中间极性和极性强的化合物，如苯酚、胺、羰基和氨基酸等。反相色谱一般非极性固定相(例如C18、c8)；流动相作为水或缓冲液，经常添加甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂，以调节维持时间。适合非极性和极性弱的化合物的分离。据统计，RPC在现代液相色谱中应

7、用最广泛，占整个HPLC应用程序的80%左右。随着柱填料的快速开发，反相色谱的应用范围逐渐扩大，应用于部分无机样品或易脱样品的分析。通常用于控制流动阶段的pH值，以控制分析过程中样品的分离。但是要注意，C18和C8使用的pH值通常为2.5到7.5(2到8)，过高的pH值溶解硅胶，过低的pH值使邦德烷基下降。据报告，可以在PH 1.510范围内工作。正气相色谱和反相色谱比较表正气相色谱反相色谱固定相极性高中低移动相极性低中高成分洗脱顺序极性优先清洗极性如上表所示，阳极处于中间时，正气相色谱和反相色谱(如氨基键固定相)没有明确的界限。离子交换色谱固定相是用离子交换树脂将苯乙烯和二乙烯交联而成的聚合

8、物骨架，将羧基、磺酸(阳离子交换树脂)或提米诺(负离子交换树脂)连接到表面的末端芳环上。分离成分从柱中分离出来。树突上电离离子可逆地交换移动相电荷相同的离子和正在测量的成分中的离子，每个离子和离子交换器根据电荷的吸引力不同而分离。缓冲液通常用作离子交换色谱的流动相。分离的成分在离子交换热中保持的时间不仅与成分离子在树脂上的离子交换作用强弱有关，还受流动上pH值和离子强度的影响。PH值改变化合物的离解程度，影响其与固定相的作用。移动上的盐浓度大，离子强度高，对样品的解离不利，使样品迅速流失。离子交换色谱法主要用于有机酸、氨基酸、多肽、核酸分析。离子对色谱甚至称为离子色谱，是液相色谱的分支。这是根

9、据正在测量的成分离子和离子对试剂离子形成中性磷离子对化合物后，非极性固定相中溶解度增加，分离效果得到改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。碱性物质分析中常用的离子对试剂是烷基磺酸盐，如戊烷磺酸盐、辛烷磺酸盐等。另外，高氯酸、三氟乙酸可以与多种碱性样品形成强离子。酸性物质的分析一般使用四丁基溴化铵、四丁基磷酸铵等四丁基季铵盐。离子对色谱一般采用ODS柱(C18)，流动相为甲醇-水或乙腈-水，在水中加入310 mmol/L的离子对试剂在一定pH值内分离。测量的成分保留时间与离子对特性、浓度、流动相组成和pH值、离子强度有关。排除色谱固定相是具有一定孔径的多孔填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。分子

10、量小的化合物可以入洞，停留时间长。分子量较大的化合物不能进入孔，直接沿流动相流动。利用分子量大小不同的各组的抗逆性差异结束分离。常用于分离组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等高分子化合物。二.基本概念和理论一、基本概念和术语1.色谱和峰值参数色谱-样品通过列和检测器流动的信号-时间曲线，也称为El ution配置文件。基线(base line) -通过流动清洗，列和流平衡后，探测器测量一段时间内的流出曲线。通常，必须与时间线平行。噪声-基线信号的波动。电源接触不良或瞬时过载，探测器不稳定，流动上有气泡或热污染。漂移-基线随着时间慢慢变化。由于电压、温度、流动相和流量的不稳定性，如果周中的污染物或固

11、定相继续溶出，就会发生漂移。Peak) -由组件通过探测器流动时响应的连续信号生成的曲线。径流曲线上方的出挑部分。正常色谱峰类似于对称正态分布曲线(高斯高斯曲线)。非对称色谱峰有两种：前峰和后峰(tailing peak)。电子很少见。测定色谱峰对称性的拖尾系数(tailing factor，t)。也称为“对称系数”(symmetry factor)或“非对称系数”(asymmetry factor)。中国药典规定t必须介于0.95和1.05之间。T 1.05是后尾峰。峰底-基线峰的起点到终点的距离。峰值高度(peak height，h)-峰值的最高点到峰值底部的距离。峰值宽度(peak wi

12、dth，W)-两条切线和基线上两个顶点之间的距离是峰值两侧的拐点。W=4半高(peak width at half-height，Wh/2)-峰值高度一半处的峰值宽度。wh/2=2.355；标准差(standard deviation，)-正态分布曲线x=1点(拐点)的峰值宽度的一半。正常峰的拐点是峰高的0.607倍。标准差的大小表示出流柱中组件的方差图。小、小分散、高极浓度、薄峰形状、高柱效应；相反，峰脂肪，柱效果低。峰值区域(peak area，A)-由峰值和峰值地面包围的区域。2.定性参数(保留值)死时间(dead time，t0) -不保留组件的保留时间。流动相(溶剂)通过列的时间。反

13、相HPLC中可用苯基磺酸盐钠测定死亡时间。死区(dead volume，V0) -从取样器入口开始，探测器流动池未占满固定空间。取样器-柱管体积、柱内固定相粒子间隙(Vm(流动占用)、柱出口管体积、探测器流动池体积等四部分。其中只有虚拟机参与色谱平衡过程，其馀三部分仅参与峰值扩展。为了防止峰值扩张，应尽量减少这三部分的体积。V 0=ft0 (f表示流速)保留时间(tR) -从示例开始到组件在柱后出现最大浓度的时间。保留体积(VR) -从样本开始，当特定组件出现在柱子后面的最大浓度时，溶剂流出的体积。也称为洗脱体积。Vr=ftr调整保留时间(adjusted retention time，tR)

14、 -扣除死亡后的保留时间。也称为收缩保留时间(reduced retention time)。tR可以定性地使用tR(或TR)，因为实验条件(温度、固定等)固定时，仅由组件的特性决定。Tr=tr-t0调整保留卷(VR) -扣除已死卷后的保留卷。3.柱效果参数理论托盘数-用于定量表示柱的分离效率(称为柱效果)。n取决于固定相的种类、特性(粒度、粒度分布等)、填充状态、支柱长度、流动类型以及用于测量流速和支柱效果的物质特性。在多组分色谱中，如果各组分含量相似，溶出的峰比以前的峰越来越宽，峰高，就会逐渐降低。用半杆宽度计算理论塔数比用峰值宽度计算更方便，也更常用。因为半杆宽度的测量更精确。特别是因为

15、有稍微吸引的峰。n与支柱增长成比例，支柱越长，n就越大。显示柱效果时，表示柱长度，否则表示理论塔板数，长度为1米。(一般HPLC栏的n等于或大于1000。)，以获取详细信息使用调整保留时间(TR)计算理论托盘数时，结果值称为有效理论托盘数(n有效或Neff)。理论托盘高度-按单位柱长度分布。在实际应用中，柱长度l和理论塔板数经常进行计算。4.相平衡参数分配系数(distribution coefficient，k)-在一定温度下，两个相之间的分配平衡时，化合物与流动浓度的比率。分配系数与元件、流动相和固定相的热力学性质相关，也与温度、压力相关。根据色谱分离机制，k有不同的吸附系数，离子交换色谱

16、有选择系数(或交换系数)，凝胶色谱有渗透参数的概念。但是，一般情况可以用分配系数表示。在条件下(流动相、固定相、温度和压力等)，样品浓度很低(Cs，Cm非常小)，k仅取决于组件的特性，与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在此条件下获得的色谱峰是正常峰。在很多情况下，k随着浓度的增加而减少，此时色谱峰是尾随峰。随着溶质浓度的增加，k也增加。这时色谱峰是前年薪。因此，通过尽可能减少样本量，组件在柱内降低浓度，仅在k恒定的情况下才能获得正常峰值。在相同的色谱条件下，样品中k值较大的成分在固定床长期停留后从柱中流出。k值小的成分停留时间短，热量先流动。混合物中各成分的分布系数越大，越容易分离，混合物中各成分的分布系数不同是色谱分离的前提。在HPLC中确定固定相后，k主要受流动相性质的影响。实际上，调整流动相组成比率和pH值，以获得成分之间的分配系数差异和适当的保留时间，达到分离目的。容量系数，k) -两个相之间达到分布平衡时固定相对流动上的化合物量。因此，容量系数也称为质量分配系数。容量系数的物理含义：表示一个