饮用水中菌落总数的测定

1、目 录中文摘要2ABSTRACT21.引言32. 材料与方法42.1实验材料42.2培养基的配制及其灭菌42.3主要仪器42.4染色液的制备42.5菌落总数的测定52.6革兰氏染色53结果63.1平板计数的结果63.2水样中细菌总数的计算63.3革兰氏染色结果74.讨论7参考文献8致谢8中文摘要摘要：本实验采用平板菌落计数法对连云港师范高等专科学校女生宿舍2A320的管道自来水，圣王桶装水及校内教育超市出售的康师傅、统一、今麦郎瓶装水分别进行了菌落总数的测定，并对其中的细菌进行培养，经过革兰氏染色和镜检，初步观察了细菌的形态和革兰氏阴阳性鉴定。实验结果表明校内管道自来水的菌落总数为66cfu/

2、ml，符合国标GB 5749-85，超市销售的康师傅、统一、今麦郎瓶装水中菌落总数分别为0.5cfu/ml、1cfu/ml、1cfu/ml,均符合国家标准GB l0789-89，而桶装水的水质不是很理想，测定的菌落总数为520cfu/ml，远超过了国标GB 19298-2003中的规定。通过本次实验，期待更多的在校师生，能够关注饮用水质量，关爱健康，增强安全用水意识。关键词:饮用水；平板菌落计数法；菌落总数的测定；革兰氏染色ABSTRACTAbstract: Total number of colonies of using plate ,Lianyungang Teachers Colleg

3、e dormitory 2A320 water pipeline, Sage Bottled Water, And school education in supermarkets sell Master Kong, unity, bottled water Jinmailang were terminated in this study by colony count method,and which the bacteria were cultured, after Gram staining and microscopy, we observed the shape of bacteri

4、a Preliminarily and Gram Identification of yin and yang The results show that the total number of campus pipeline water for the colony were 66cfu/ml, meet the national standard GB 5749-85, Master Kong supermarket sales, unity, bottled water Jinmailang total number of colonies were 0.5cfu/ml, 1cfu/ml

5、, 1cfu/ml,meet the national standard GB l0789-89,however the water quality of bottled water is not very satisfactory, the determination of the total number of colonies were 515cfu/ml, which far exceeding the national standard GB 19298-2003 in the regulations. Through this experiment, looking for mor

6、e teachers and students, to focus the quality of drinking water, health care, increased awareness of safe water.Keywords: drinking water, lat colonies notation, The etermination of total colonies,Grams staining 饮用水中菌落总数的测定1.引言各种天然水中常含有一定数量的微生物。水中微生物的主要来源有：水中的水生性微生物（如光合藻类）、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜

7、的排泄物等。水中的病原微生物主要来源于人和动物的传染性排泄物。水是生命之源，和阳光、空气一样，是生命不可或缺、最基本、最必需的自然资源。水参与了生物体内所有的生理生化过程，同时又是体内进行系生化反应的良好场所。故水的微生物检验在保证饮水安全和控制传染病上有着重要的意义，同时也是评价水质状况的重要指标。国家饮用水标准GB 5749-85规定，菌落总数不得超过100 cfu/g(ml)，所用的方法是稀释平板计数法。平板菌落计数法是将等测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散为单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成的肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一

8、个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。根据我校的实验条件，本实验拟选用国标规定的平板菌落计数法，对我校女生宿舍2A320的管道自来水，圣王桶装水及校内教育超市出售的康师傅、统一、今麦郎瓶装水进行了菌落总数的测定，为全校师生的饮水安全提供理论和实践依据。2. 材料与方法2.1实验材料随着生活水平的提高，人们对水的质量有了高要求，生产商择世所需，引进了先进的净水设备，来满足不同层次的人群需求。小区居民喝自来水，办公室人员喝桶装水，学生则喝瓶装水的居多，针对以上情况，本实验选取的水样是连云港师范高等专科学校女生宿舍2A320的管道自来水、圣王桶装水和校内教育超市出

9、售的康师傅、统一、今麦郎三种常见瓶装水。详情见表1。表1 样品编号及存放时间样品名称样品编号实验日期存放时间(天）量取体积（ml）管道自来水ZS2010.11.15/15圣王桶装水ST2010.11.15315康师傅KS2010.11.152515统 一TS2010.11.152315今麦郎JS2010.11.1526152.2培养基的配制及其灭菌由于水中的细菌种类繁多，它们对营养和其它生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖。因此本实验采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基培养出的细菌总数仅是一种近似值。本培养基的主要成分有：牛肉膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂

10、，自来水1。根据配置培养基的体积，事先加水溶解已经量取好的相应质量的牛肉膏、蛋白胨、氯化钠，然后加入到未沸的600-700ml的自来水中，边加热边用玻璃棒搅拌，待水沸腾后加入琼脂，再加水至1000ml，不断地搅拌直到液体呈半透明状将其取下，分装。分装好的培养基运用高压蒸汽灭菌，121，15min即可2。2.3主要仪器手提式高压灭菌锅（型号：YX280A）、超净工作台（型号：SW-CJ-1B）、恒温培养箱（型号：PYX-120）、显微镜（型号：OLYMPUS CH20）。2.4染色液的制备革兰氏染色实验需要的染色液有:草酸钙结晶紫、碘液、95%的乙醇、番红3。草酸钙结晶紫的制备:先将2.0g结晶

11、紫溶于20ml95%的酒精，0.8g的草酸铵溶于80ml蒸馏水中，然后将两液混合，静置48小时使用。碘液的制备:先将1.0g碘与2.0g碘化钾混合，加水少许，略加摇动，待碘完全溶解后再加蒸馏水定容至300ml。95%的乙醇的制备:将95ml的乙醇溶入100ml的水中。番红的制备:将0.25g沙黄溶解于10ml95%的乙醇中，待完全溶解再加蒸馏水至100ml。2.5菌落总数的测定采用国标中规定的平板菌落计数法，详细步骤见下。2.5.1水样的采取自来水，先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，待用。桶装水，取未打开的桶装水，打开盖子倒入灭菌的锥形

12、瓶中，待用。瓶装水，在超净工作台上打开盖子将水倒入灭过菌的锥形瓶中，待用。2.5.2水样稀释及培养2.5.2.1水样稀释 取3个灭菌空试管，分别加入9ml灭菌水。取lml水样注入第一管9ml灭菌水内、摇匀，再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10-1、10-2与10-3。管道自来水、圣王桶装水和三种瓶装水分别按照以上叙述进行稀释。通过预实验，本实验所采用的管道自来水的水样稀释度为100，圣王桶装水的水样稀释度为10-1，康师傅、统一、今麦郎三种瓶装水的水样稀释度均为1004。2.5.2.2制作平板 用一支灭菌吸管吸取lml水样，注入灭菌培养皿中,共做两个平皿。另取

13、一支灭菌吸管吸取1ml灭菌的蒸馏水，注入灭菌培养皿中，共做两个皿，作为空白对照。分别在以上四个培养皿中倾注约15mL己溶化并冷却到45左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。管道自来水、圣王桶装水和三种瓶装水分别按照以上叙述进行制作平板。每个水样两个平行样，共做十个平板，外加每个水样一个空白对照板。2.5.2.3菌落培养 待培养基凝固后，倒置于37 恒温培养箱中，培养48h。2.6革兰氏染色本实验采用革兰氏染色法对细菌菌落进行染色，革兰氏染色一般包括初染、媒染、脱色、复染、镜检五个步骤，染色制片后选用OLYMPUS CH20显微镜，在油镜下进行镜检。具体操作

14、方法如下5。 2.6.1涂片固定 在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，固定。 2.6.2初染 草酸铵结晶紫染2分钟，自来水冲洗，去掉浮色。 2.6.3媒染 用碘-碘化钾溶液媒染1分钟，倾去多余溶液。 2.6.4脱色 用中性脱色剂如乙醇（95%）或丙酮酸脱色30秒，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。 2.6.5复染 用蕃红染液复染2分钟，水洗。2.6.6镜检 干燥后用油镜观察，革兰氏阳性菌仍呈蓝紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。以分散开的细菌革兰染色反应为准，过于密集的细菌常由于脱色不完全而呈假阳性。3结果3.1平板菌落计数的结果用直接计数法，记录

15、每个水样每个平板的菌落数，然后计算每个水样同一稀释度的两 个平板的平均菌落数。本实验管道自来水水样中的平均菌落数为66，且两个平行样间的菌落数相差小于5%；圣王桶装水水样中的平均菌落数为52，且两个平行样间的菌落数相差小于5%；康师傅、统一、今麦郎瓶装水的水样中的平均菌落数分别为0.5、1、1,且两个平行样间的菌落数相差均小于5%，详细结果见表2。表2 水样中菌落计数的结果样品编号CKCS1菌落数CS2菌落数平均菌落数ZS0686466ST0535152KS0010.5TS0111JS01113.2水样中菌落总数（cfu/ml）的计算因为本实验只有一个稀释度，所以计算公式为：N=C/2d公式中

16、：N样品中菌落数C平板中菌落数之和d稀释度3.2.1管道自来水菌落总数的计算 本实验采用的管道自来水的稀释度为100，两个平行样的菌落数分别是68和64,代入公式N=（68+64）/2,N=66。即管道自来水的菌落总数为66cfu/ml。3.2.2圣王桶装水菌落总数的计算 本实验采用的圣王桶装水的稀释度为10-1，两个平行样的菌落数分别是53和51,代入公式N=（53+51）/210,N=520。即圣王桶装水的菌落总数为520cfu/ml。3.2.3康师傅菌落总数的计算 本实验采用的康师傅的稀释度为100，两个平行样的菌落数分别是0和1，代入公式，康师傅N=（0+1）/2,N=0.5。即康师傅

17、的菌落总数为0.5cfu/ml。3.2.4统一菌落总数的计算 本实验采用的统一的稀释度为100，两个平行样的菌落数分别是1和1，代入公式，统一N=（1+1）/2,N=1。即统一的菌落总数为1cfu/ml。3.2.5今麦郎菌落总数的计算 本实验采用的今麦郎的稀释度为100，两个平行样的菌落数分别是1和1，代入公式，今麦郎N=（1+1）/2,N=1。即今麦郎的菌落总数为1cfu/ml。3.3革兰氏染色结果管道自来水平板中的菌落经革兰氏染色后，在油镜下观察，细菌形态有短杆、梭状、长杆，且分别被染成红色、蓝紫色、蓝紫色；圣王桶装水平板中的菌落经革兰氏染色后，在油镜下观察，细菌形态有短杆、梭状、长杆，且

18、分别被染成红色、蓝紫色、蓝紫色；三种瓶装水平板中的菌落经革兰氏染色后，在油镜下观察，细菌形态有短杆、梭状、长杆，且分别被染成红色、蓝紫色、蓝紫色。详情见表3。表3 革兰氏染色结果细胞形态革兰氏染色颜色结果判断短杆红色革兰氏阴性梭状蓝紫色革兰氏阳性长杆蓝紫色革兰氏阳性4.讨论对照生活饮用水国标GB 5749-85中规定菌落总数不超过100cfu/ml，桶装引用水国标GB 19298-2003中规定菌落总数不超过50cfu/ml和瓶装饮用矿泉水GB l0789-89国标中规定菌落总数不超过20cfu/ml。本实验数据显示：连云港师范高等专科学校女生宿舍楼2A320的管道自来水的菌落总数为66cfu

19、/ml符合国家标准；但是圣王桶装水的菌落总数为520cfu/ml,远超过了国标规定，污染较严重；校内教育超市出售的康师傅、统一、今麦郎瓶装水的菌落总数分别为0.5cfu/ml,1cfu/ml,1cfu/ml，均符合国家标准。圣王桶装水中的菌落总数超标的可能原因分析如下：水生产出来后放置时间有些长，会滋生很多细菌；水在生产过程中净化装置没有及时更新；由于条件的限制，取样时水样受到污染；桶内壁没有彻底消毒、杀菌等。本次实验测定的桶装水是刚刚打开盖子的，其细菌总数已超标，随着饮用时间的推移，水中细菌数将不断增长，饮用后对人体的危害较大，针对以上情况，为了确保饮水安全，首先我们应该尽早饮用（夏天最好三

20、天内，冬天一周内），其次，把水烧开后再饮用。桶装水、瓶装水对人体可能存在有不确定的危害因素，饮用管道自来水相比较安全。本实验通过对水样中菌落总数的计算，简单的判断了水样中的菌落总数是否符合国家标准，并对培养基生长的微生物进行了革兰氏染色。然而水样中的微生物种类（如大肠杆菌）的检测还有待于将来做进一步分析。参考文献1 庞俊兰.细胞工程M.高等教育出版社,2007-06-01,第1版 .2 赵玉娥.生物化学M.化学工业出版社,2005-06-01,第1版. 3 叶磊,杨学敏.微生物检测技术M.化学工业出版社,2009-05,第1版.4 丁兴华.食品检验工M.机械工业出版社,2006-05-01第1版.5 黄秀梨,辛明秀.微生物学实验指导M.高等教育出版社,2008-01,第2版.致谢经过半年的忙碌和工作，毕业论文设计已经接近尾声，作为一个专科生的毕业论文，由于专业知识的学习较浅显和实验操作能力较差，实验过程中难免有许多考虑