青霉素的发酵工艺概况

1、青霉素的发酵工艺概况摘要：自工业生产青霉素(penicillins)以来，青霉素以其毒性低、药效可靠等优点被广泛应用。进入上世纪90年代中期后，中国的抗生素生产企业，凭借较低的生产成本、丰富的原料资源和宽松的经营环境，使我国青霉素类药物的发展进入黄金时期。在这个大背景下，本文试图大致地介绍青霉素的生产研究进程。关键词：青霉素，发酵，菌种，代谢调控。引文青霉素是指分子中含有青霉烷，能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，又被称为青霉素G、peillin G、 盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾等。青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分

2、子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素类抗生素是-内酰胺类中一大类抗生素的总称。但它不能耐受耐药菌株(如耐药金葡)所产生的酶，易被其破坏，且其抗菌谱较窄，主要对革兰氏阳性菌有效。在过去的近60年里，青霉素这个世界上第一个应用于临床的抗生素一直长盛不衰，主要原因不仅在于青霉素具有抗革兰氏阳性菌的抗菌谱广、活性强、低毒性等优点，更重要的是从20世纪60年代以来，药学家成功地改造出6APA、7ADCA和GCLE三大母核，用三大母核和不同的原料可以合成阿莫西林、氨苄西林、氨氯西林、头孢氨苄、头孢拉定、头孢匹罗、头孢吡肟等多

3、种半合成抗生素。目前，以青霉素为原料的半合抗产品发展到70多种，四分之三的青霉素原粉被深加工成半合成抗生素，半合抗的快速发展又反过来拉动了青霉素原粉产量的快速增加，预计2002年全球产量将达到3.7万吨，2003年将达到4.5万吨以上3。 进入上世纪90年代中期后，西方发达国家的生产企业迫于利润和环保的压力，逐步停止了青霉素的生产，使发展中国家，尤其是中国和印度的抗生素生产企业，凭借较低的生产成本、丰富的原料资源和宽松的经营环境，迅速提高了青霉素的产量和市场份额，从而使我国青霉素类药物的发展进入黄金时期。2002年，我国生产的青霉素原粉不仅产量超过2万吨，接近世界总产量的三分之二，成为世界上最

4、大的青霉素生产国，而且还可以生产大多数的半合成抗生素品种，并且相当多的品种形成了出口能力。1菌种选育稳定、高产菌株的筛选在青霉素生产过程中起着极其关键的作用，所以选育一株优良的抗生素产生菌以提高青霉素的发酵效价和提高产量，是抗生素制药企业得以生存和发展的关键。自然选育是一种纯种选育的方法，它利用微生物在一定条件下产生自发变异的原理，通过分离，达到纯化、复壮菌种，稳定生产的目的。自然选育也可用来选育高产量突变株以提高生产，不过正突变的机率很低。所以我们经常把紫外线诱变育种方法与其结合使用，经过初筛、复筛等一系列工作，便最终能筛选得到一株高产菌株。张春雷等人1的研究工作采用985#为出发菌株，采用

5、紫外诱变，初筛复筛后获得一高产菌株985。989#菌株发酵单位比原出发菌株985提高了1003，是一个高产菌株，效价对比见表1，稳定性考查见表2。表1摇瓶效价对比考察结果另一事例：韩斌等人的研究7以青霉索生产菌株20#为出发菌株，经紫外线照射诱变处理，再分别用含有缬氨酸、6一氨基青霉烷酸、苯乙酸的培养基定向筛选，得到高产突变菌株431#。该菌株遗传特性稳定，代谢特性优于出发菌株，经生产验证，其发酵效价和总产量分别比对照菌株提高7和76。李涛等人的研究9提出了一种方法：以青霉茵产生茵原生质体来代替青霉素产生茵袍子作为诱变育种的材料进行紫外光处理。结果表明其诱发率突变频率和诱变育种的效率均得以大幅

6、度的提高，原生质体诱变后所获得新菌种，具有单位高，发酵总价高，糖耗低等优良特性。2培养基优化青霉素生长需要碳，氮，无机盐等，所以培养基中需要包含这些成分。青霉菌能利用多种碳源如乳糖、蔗糖、葡萄糖等。目前采用淀粉水解糖，糖化液进行流加。氮源可采用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或麸皮粉等有机氮源，及氯化氨、硫酸氨、硝酸氨等无机氮源。前体为生物合成含有苄基基团的青霉素G，需要在发酵中加入前体如苯乙酸或苯乙酰胺。由于它们对青霉素有一定毒性，故一次加入量不能大于0.1%，并采用多次加入方式。无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等盐类。铁离子对青霉素有毒害作用，应严格控制发酵液中铁含量在30ug/mL以下。2.1

7、培养基优化的原理一个批发酵（流加发酵）可分为生长期和产物形成期两个阶段。在生长期要控制菌体的生长，使长好的菌体能够处于最佳的产物合成状态，即如何控制有利于微生物催化产物合成所需酶系的形成。产物形成期要控制产物的合成，找出影响反应速度变化的主要因素并加以控制使产物的形成速度处于最佳或底物的消耗最经济。2.2用正交实验确定最优培养基一、根据问题的要求确定因子和水平，列出因子水平表，如碳源，氮源，无机盐为因子，各种因子的不同浓度为水平。二、根据因子和水平数选用合适的正交表，设计表头，安排实验。三、根据正交表给出的实验方案，进行实验，即按正交表的实验因素和水平配制培养基并接种同一菌种，其他条件保持一致

8、。四、对实验结果（青霉素效价）进行分析，选出较优的实验条件以及对结果有显著影响的因子。3、青霉素的生产工艺流程与代谢调控3.1青霉素生产工艺流程&|%E-m0O#E!3.1.1丝状菌三级发酵工艺流程!t7e;C,z$M7l%h2h;U冷冻管（25C，孢子培养，7天）斜面母瓶（25C，孢子培养，7天）大米孢子（26C，种子培养56h,1:1.5vvm）一级种子培养液（27C，种子培养，24h,1:1.5vvm）二级种子培养液（2726C,发酵,7天,1:0.95vvm）发酵液。4w+b#R!?*d1?$_9r3.1.2球状菌二级发酵工艺流程j0%R#D4M#

9、o6j冷冻管（25C，孢子培养，68天）亲米（25C，孢子培养，810天）生产米（28C，孢子培养，5660h,1:1.5vvm）种子培养液（2625-24C，发酵，7天，1：0.8vvm）发酵液。f#Us2N;W#N6D:E Z中国植物提取物论坛 3.2青霉素合成过程青霉素结构：青霉素的生物合成途径：*K;X58i1o4I植提之家,植提空间,中国植提论坛,植提论坛,植提网3.3影响青霉素发酵产率的因素与代谢调控3.3.17GI&X:Yj,O2x4?基质浓度 在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏（或抑制）或对菌丝生长产生抑制（如葡

10、萄糖和钱的阻遏或抑制 , 苯乙酸的生长抑制）, 而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成 , 为了避免这一现象 , 在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法 , 即对容易产生阻遏、抑制和限制作用的基质进行缓慢流加以维持一定的最适浓度。这里必须特别注意的是葡萄糖的流加 , 因为即使是超出最适浓度范围较小的波动 , 都将引起严重的阻遏或限制 , 使生物合成速度减慢或停止。目前 , 糖浓度的检测尚难在线进 行 , 故葡萄糖的流加不是依据糖浓度控制 , 而是间接根据pH 值、溶氧或 C02 释放率予以调节。中国植物提取物论坛00T7%A)C&m3e:/l3.3.2温度 青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同

11、可能稍有差别 , 但一般认为应在25 C 左右。温度过高将明显降低发酵产率 , 同时增加葡萄糖的维持消耗 , 降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说 , 最适温度不是一样的, 一般前者略高于后者, 故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间, 到达生产阶段后便适当降低温度 , 以利于青霉素的合成。4R;CA$_9I6L*H4|3g k3.3.3 pH 值 青霉素发酵的最适 pH 值一般认为在 6. 5 左右 , 有时也可以略高或略低一些 , 但应尽量避免 pH 值超过7.0, 因为青霉素在碱性条件下不稳定, 容易加速其水解。在

12、缓冲能力较弱的培养基中, pH 值的变化是葡萄糖流加速度高低的反映。过高的流加速率造成酸性中间产物的积累使 pH 值降低； 过低的加糖速率不足以中和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生的碱性化合物而引起 pH 值上升。2t)WU3!g3S!i植提之家,植提空间,中国植提论坛,植提论坛,植提网3.3.4溶氧对于好氧的青霉素发酵来说 , 溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素。当溶氧浓度降到 30% 饱和度以下时, 青霉素产率急剧下降, 低于 10% 饱和度时, 则造成不可逆的损害。溶氧浓度过高 , 说明菌丝生长不良或加糖率过低, 造成呼吸强度下降, 同样影响生产能力的发挥。溶氧浓度是氧传递

13、和氧消耗的一个动态平衡点, 而氧消耗与碳能源消耗成正比, 故溶氧浓度也可作为葡萄糖流加控制的一个参考指标。/r1,4P-m8u23.3.5菌丝浓度发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度, 从而使氧传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。青霉素发酵的临界菌体浓度随菌株的呼吸强度 (取决于维持因数的大小, 维持因数越大,呼吸强度越高) 、发酵通气与搅拌能力及发酵的流变学性质而异。呼吸强度低的菌株降低发酵中氧的消耗速率，而通气与搅拌能力强的发酵罐及黏低的发酵液使发酵中的传氧速率上升, 从而提高临界菌体浓度。中国植提论坛|植提网4V/yB8o:w9f*u

14、6q3.3.6菌丝生长速度用恒化器进行的发酵试验证明，在葡萄糖限制生长的条件下，青霉素比生产速率与产生菌菌丝的比生长速率之间呈一定关系。当比生长速率低于0.015h-1时，比生产速率与比生长速率成正比, 当比生长速率高于 O. 015h-1时, 比生产速率与比生长速率无关 D 因此, 要在发酵过程中达到并维持最大比生产速率, 必须使比生长速率不低0.015h-1 。这一比生长速率称为 临界比生长速率。对于分批补料发酵的生产阶段来说, 维持0.015h斗的临界比生长速率意味着每 46h 就要使菌丝浓度或发酵液体积加倍, 这在实际工业生产中是很难实现的。事实上 , 青霉素工业发酵生产阶段控制的比生

15、长速率要比这一理论临界值低得多, 却仍然能达到很高的比生产速率。这是由于工业上采用的补料分批发酵过程不断有部分菌丝自溶, 抵消了一部分生长, 故虽然表观比生长速率低, 但真比生长速率却要高一些。中国植提论坛|植提网0j)-e)1|-I9h,G3.3.7菌丝形态 在长期的菌株改良中 , 青霉素产生菌在沉没培养中分化为主要呈丝状生长和结球生长两种形态。前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触, 故一般比生产速率较高； 后者则由于发酵液黏度显著降低, 使气-液两相间氧的传递速率大大提高, 从而允许更多的菌丝生长 (即临界菌体浓度较高), 发酵罐体积产率甚至高于前者。%C3?.n#Z0X;P

16、,)b0x,r8P中国植物提取物论坛 在丝状菌发酵中, 控制菌丝形态使其保持适当的分支和长度, 并避免结球 , 是获得高产的关键要素之一。而在球状菌发酵中, 使菌丝球保持适当大小和松紧 , 并尽量减少游离菌丝的含量, 也是充分发挥其生产能力的关键素之一。这种形态的控制与糖和氮源的流加状况及速率、搅拌的剪切强度及比生长速率密切相关。4、青霉素的提取对于青霉素提取工艺，许多学者进行了广泛研究 ，Sy|vester、Row|ey等对提取理论和工艺进行了讨论。Rusin、Souders等也 分别从萃取设备和工艺条件方 面对醋酸丁酯体系萃取青霉素进行大量研究。目前在提取过程中应用最广泛的是溶媒萃取法，大

17、多采用醋酸丁酯为萃取剂，碳酸氢钠水溶液为反萃取剂。但该工艺 存在明显的缺点：在低pH条件下萃取，青霉素降解损失严重；低温下操作，生产能耗大；醋酸丁醑水溶性大，溶剂回收困难等。近年来，由于青霉索生产量剧增，造成供过于求的状况，因此改革工艺降低成本，是迫在眉睫的任务，许多研究者竞相开发新的工艺、方法和设备2。青霉素提纯流程见图一。 现在较为热门的青霉素萃取体系为：一、 胺类萃取体系二、 中性膦类萃取体系三、 亚砜类萃取体系除萃取获得青霉素外，还有其他的提取方法，如双水相萃取，反胶团萃取，支撑液膜萃取，膜分离等。7x3/zK*k7k-)M中国植物提取物论坛四，四四5、青霉素生产工艺控制5.9p3z/

18、a!c!y:a)Z1种子质量的控制 丝状菌的生产种子是由保藏在低温的冷冻安瓿管经甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固体上，25 C 培养 7 天, 真空干燥并以这种形式保存备用。生产时它按一定的接种量移种到含有葡萄糖、玉米浆、尿素为主的种子罐内 ,26 C 培养 56h 左右, 菌丝浓度达6%-8%, 菌丝形态正常, 按 10%-15%的接种量移人含有花生饼粉、葡萄糖为主的二级种子罐内,27C 培养 24h, 菌丝体积 10%-12%, 形态正常, 效价在700D/ml左右便可作为发酵种子。中国植物提取物论坛&X+z;q0m2a#Q 球状菌的生产种子是由冷冻管子孢子经混有O. 5% -1. 0

19、 %玉米浆的三角瓶培养原始亲米孢子, 然后再移人罗氏瓶培养生产大米抱子 (又称生产米), 亲米和生产米均为25 C静置培养, 需经常观察生长发育情况在培养到 3-4 天, 大米表面长出明显小集落时要振摇均匀, 使菌丝在大米表面能均匀生长, 待10 天左右形成绿色孢子即可收获。亲米成熟接人生产米后也要经过激烈振荡才可放置恒温培养, 生产米的孢子量要求每粒米300万只以上。亲米、生产米子孢子都需保存在 5 C冰箱内。!F8y2N!X9z6kY8?(t 工艺要求将新鲜的生产米 (指收获后的孢瓶在10天以内使用) 接人含有花生饼粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、饴糖为主的种子罐内,28 C 培养 50-60h当

20、pH 值由6. 0-6. 5 下降至 5.5-5. 0, 菌丝呈菊花团状,平均直径在 100- 130m, 每毫升的球数为 6万 -8万只, 沉降率在 85% 以上, 即可根据发酵罐球数控制在 8000-11000只/ml 范围的要求, 计算移种体积, 然后接入发酵罐, 多余的种子液弃去。球状菌以新鲜孢子为佳, 其生产水平优于真空干燥的孢子，能使青霉素发酵单位的罐批差异减少。5.-0R0Js-y)a&N9S7P2培养基成分的控制5.2.19Z7?-b;$C中国植物提取物论碳源 产黄青霉菌可利用的碳源有乳糖、蕉糖、葡萄糖等。目前生产上普遍采用的是淀粉水解糖、糖

21、化液 (DE 值 50% 以上) 进行流加。5.2.2I,r1U1z6d!D!o&F+I+O中国植物提取物论坛氮源 氮源常选用玉米浆、精制棉籽饼粉、麸皮，并补加无机氮源（硫酸氨、氨水或尿素）。中国植提论坛|植提网2X.|6H9!H7C/Y5.2.3前体 生物合成含有苄基基团的青霉素 G, 需在发酵液中加人前体。前体可用苯乙酸、苯乙酰胺, 一次加入量不大于0.1%, 并采用多次加入, 以防止前体对青霉素的毒害。5.&K0M$M*P1o6T+x3s)w9Z2.4无机盐加入的无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等, 且用量要适度。另外, 由于铁离子对青霉菌有毒害作用, 必须严格控制铁离子的浓度, 一般控制在

22、30 g/ml 。5.7|+Q1v8Q6S*w中国植提论坛|植提网3发酵培养的控制中国植物提取物论坛-D#?)$cw1mt#5.3.1加糖控制 加糖量的控制是根据残糖量及发酵过程中的 pH 值确定 , 最好是根据排气中CO2 量及 O2 量来控制, 一般在残糖降至 0.6% 左右, pH 值上升时开始加糖。5.98G#x1q6p*| K0y9?W3.2补氮及加前体 补氮是指加硫酸铵、氨水或尿素, 使发酵液氨氮控制在 O. 01%-0.05%,补前体以使发酵液中残存苯乙酰胺浓度为 0.05%-0.08% 。5.&W6d5E&-K-W/7v3.3 pH 值控制对pH 值的要求视不同菌种而异, 一般

23、为 pH 6.4-6.8, 可以补加葡萄 糖来控制。目前一般采用加酸或加碱控制pH值。(Z1n.J2c1DD80k#i5.3.4 温度控制 前期 2 5- 2 6 C, 后期 23 C, 以减少后期发酵液中青霉素的降解破坏。5.Z#3t,h-li56L植提之家,植提空间,中国植提论坛,植提论坛,植提网3.5 溶解氧的控制 一般要求发酵中溶解氧量不低于饱和溶解氧的30% 。通风比一般为1 : 0. 8L/(L min), 搅拌转速在发酵各阶段应根据需要而调整。.q8wT(d$U-A9L5B-h5.3.6 泡沫的控制 在发酵过程中产生大量泡沫, 可以用天然油脂, 如豆油、玉米油等或用化学合成消泡剂 泡敌 来消泡, 应当控制其用量并要少量多次加入, 尤其在发酵前期不宜多用, 否则会影响菌体的呼吸代谢。8J;b13c$r#J5.3