好实验四 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清

1、实验五醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质，实验目的，电泳法掌握血清蛋白质分离原理掌握血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳的操作方法。 1 .电泳：带电粒子移动到电场中与自身带电的电荷相反的电极的现象。 在一定的pH条件下，不同的蛋白质由于具有不同的等电点而具有不同性质的电荷，所以在一定的电场中，移动方向和移动速度不同，即电泳迁移率不同，因此2 .影响电泳迁移率的因素：内在因素：蛋白质所具有的净电荷的量， 蛋白质的大小和形状外部因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗透现象、实验原理、3 .血清中各种蛋白质的等电点在pH4.07.3之间，在pH8.6的缓冲溶液中带有负电荷，在电场中向正电荷移动。

2、由于血清中各种蛋白质的等电点不同，带电量也不同。 另外，由于各蛋白质分子的大小不同，所以在相同电场下游泳的速度不同。 分子小电荷多的人，游泳快，相反慢。 4 .醋酸纤维素溶解在有机溶剂(丙酮、氯仿、氯乙烯、醋酸乙酯等)中后，涂布在均匀的薄膜上就成为醋酸纤维素薄膜。 该膜具有均匀的泡状结构，厚度约为120 m，具有强透射性，分子的移动阻力小。 该薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨率高、样品无拖尾和吸附现象等优点。 目前广泛用于血清蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、血红蛋白、酶的分离和免疫电泳等。 5 .醋酸纤维素薄膜电泳将血清蛋白质按电泳速度分为5个区，从正极端依次为白蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白、球

3、蛋白，通过染色可以计算各蛋白质的含量。 实验器材，1 .电泳计：为电泳提供直流电源。 2 .电泳槽：为电泳提供场所。 3 .血清取样器：可以使用玻璃罩或微量取样器。 乙酸纤维素薄膜： 2cm8cm 5.其他：培养皿(直径9-10cm )、滤纸、镊子等。 实验材料和试剂，材料：牛血清试剂： 1，巴比妥-巴比妥酸钠缓冲液(ph 8.6 ) 2，0.5 %氨基黑10B染色液3，冲洗液，实验操作，1 .电泳槽准备电泳槽有相互隔离的两个槽，分别有缓冲液每个沟都有可移动的横杆，滤纸的一方挂在横杆上，另一方浸在缓冲液中形成了滤纸桥。 漂亮的醋酸纤维薄膜在滤纸桥上。 2 .醋酸纤维素薄膜的润湿是将醋酸纤维素薄

4、膜在缓冲液中浸渍约30min后，用镊子小心地夹住薄膜的一端，放入折叠的滤纸中，用滤纸吸收表面的液体。 3 .把样品铺在玻璃板上(没有光泽的面朝上)，把样品放在血清中(最好变薄)，在薄膜边缘1.5-2cm处轻轻水平卸下，马上提起，在薄膜上涂上细条状的血清样品。 (这一步是实验的关键！ 4 .电泳是将样品端的薄膜平坦地贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(样品面朝下)，另一端平坦地贴在阳极端子支架上(参照下图)。 胶卷贴在滤纸桥上贴得笔直，中途不可下垂。 连接电泳器。 在室温下进行电泳，打开电源开关，将电流强度0.3mA/cm膜宽的电泳时间调节为约1h。 电泳后，关闭电泳器，切断电源。 5 .染色：电泳结

5、束后取下薄膜，在含有氨基黑10B染色液的培养皿中浸渍5-10分钟。 (染色液回收)6.漂洗：从染色液中取出薄膜，在自来水下冲洗多馀的染色液后，放入装有冲洗液的培养皿中漂洗，直到背景变蓝为止，能获得色带清晰的电泳图像。 正常血清醋酸纤维素膜的电泳图像为1 .白蛋白2，3，4，5，分别以1-、2-、-、-球蛋白6 .为点原点，注意事项1、膜的浸润和选择膜是电泳成败的关键之一。2、制作样品时，最好用滤纸吸收薄膜表面多馀的缓冲液，以免吸水量弄湿。 3、点花纹时，动作轻、稳定，不要用力过度。 不会损伤胶卷，也不会给电泳区的胶带分离效果带来影响。 4、样品应该贴在胶片的毛面上，样品量适量，不可过多或过少。 5、电泳时，必须将薄膜点的边缘放在电泳槽的负边缘，点的边缘朝下。 6 .必须控制染色时间。 时间长，薄膜底色难以脱落的时间太短，难以区分着色，条纹染色不均匀，可以根据需要进行再染色。 比较了思考问题、1、醋酸纤维薄膜电泳与纸电泳的异同点。 57348； 2、指出