工业微生物育种学

1、第五节 温敏突变株的筛选,温度敏感突变型,在诱变处理后的群体中能分离到这样一类突变株，他们在许可的温度下能正常生长，其表型和野生型没有区别，在非许可的温度条件下不能生长或微弱生长，表型与野生型不同，称这种条件致死突变株为温度敏感突变型。,一、温敏突变株的来由和特性,温敏突变株的历史,TS突变株是在1963年Epstein.R.H等最先用于大肠杆菌及其细菌噬菌体的研究。 1978年，日本Momose由棒杆菌中选育到在过量生物素存在下也能大量合成谷氨酸的TS突变株。,温敏突变株的应用,1 TS突变株用于工业微生物领域。 2 TS突变株为遗传学研究的工具。可阐明大分子生物合成及细胞分裂循环过程机制、

2、RNA多聚酶合成缺陷、DNA复制缺陷以及研究某一特定阶段基因作用的产物等。,温敏突变株形成机理,TS突变体主要由必需基因引起的，有时也可由非必需基因产生。但后者形成的温敏突变体在非许可温度下生长时，需要补充其他条件。 基因突变后。酶蛋白一级结构的氨基酸序列发生一定的变化，但酶的活性中心未改变。 酶的合成或功能都由温度所控制。酶蛋白对高温或低温产生敏感性，在非许可温度下就会部分或完全失活。,根据菌落生长情况分类,一类：是非必需基因突变形成的TS突变株。是一类突变引起失去单一但可以补偿功能（单一酶）的TS突变株。在30基本培养基上生长，在40基本培养基上不生长，而在40的完全培养基上生长。说明该突

3、变体从完全培养基中补充了某种生长因子而得以生长。,根据菌落生长情况分类,另一类：是必需基因突变引起的TS突变株。在30基本培养基上生长，而在40的基本培养基和完全培养基上都不生长。 通常温敏突变株是指后一类。,温敏突变体的特性,在许可温度下培养时酶的活力、菌体生长和代谢都属正常。当菌体生长到一定阶段，转移到非许可温度时，可以使突变体从正常状态转入具有某种特性的非生长状态，即停止生长，酶活力逐渐丧失，导致细胞某些结构改变，从而使发酵目的产物得以不断合成累积和往外分泌。 这种特性对工业发酵是相当有利的。,温敏突变株的温度范围,细菌：3040 放线菌：3038 酵母菌：2336,二、温敏突变株的筛选

4、方法,TS突变株主要由基因错义突变所致，所以使用诱变剂时，要选择易于引起碱基置换的亚硝基类、磺酸酯类化合物，或亚硝酸、紫外线等诱变剂。处理方法和剂量选择同常规育种。,（一）富集,TS突变株的出现频率极低，仅有0.1%左右，因此在筛选前要进行突变体富集。,富集的方法,1 抗生素法 2 物理方法（过滤或离心法） 3 H3-前体法,1 抗生素法,将诱变后的菌体在非许可的温度下，培养一段时间后，加入抗生素（细菌类采用青霉素，真菌类采用制霉菌素），此时可杀死或杀伤在该温度下生长的野生型菌，不可能杀死在同样温度条件下未曾生长的TS突变株，离心，除去抗生素，进行分离。,2 过滤或离心法,知识背景：某些TS突

5、变体是DNA复制缺损或孢子萌发缺损的突变株，这种突变株可以在非许可温度下生长，细胞能伸长成丝状，或芽枝不脱落母细胞，致使比重比野生型菌株大。 方法：将诱变后的菌体在非许可的温度下，培养一段时间后，用薄膜过滤或密度梯度离心等方法，把突变株和野生型分开。,3 H3-前体法,背景知识；富集某种大分子合成缺损的TS突变株，可以加入相应的H3-前体物质，使之掺入到大分子中，在长时间低温保存的过程中细胞会由于射线损伤而死亡。 方法；把诱变后的菌体在非许可温度下培养，并加入H3-前体物质，培养一段时间后，将细胞保存在低温下，野生型被射线杀死。,RNA合成缺损TS突变株H3-尿嘧啶 蛋白质合成缺损TS突变株H

6、3-氨基酸 磷脂合成缺陷TS突变株H3-甘油磷酸,（二） 分离筛选,1 常规法 2 特殊分离筛选法,三、温敏突变株 在工业生化中的应用,（一） 谷氨酸的发酵,根据谷氨酸的发酵机制，增加谷氨酸产量的关键在于菌体培养期间细胞膜结构和功能上的特异性变化。,增加细胞膜透性的方法,1 添加表面活性剂 2 添加青霉素 3 应用生物素缺陷型菌株 4 应用油酸缺陷型菌株 5 应用甘油缺陷型菌株,Momose等用乳糖发酵杆菌NO2256为出发菌株，通过诱变，从一万多个菌落中获得细胞膜结构或功能缺损的TS突变株88号，通过温度调节来控制细胞膜透性。,表7-16：TS88在高生物素浓度下积累谷氨酸,正确的温度转移应

7、该使菌体生长进入一定阶段，菌体细胞数量达到一定浓度时进行。转温后还要维持菌体进行适度的剩余生长，剩余生长太多，说明细胞未能有效地完成谷氨酸累积的生理变化；剩余生长太少，说明给积累型细胞来不及向累积型细胞转变就被高温抑制。,应用温敏突变株进行谷氨酸发酵时， 转温时间的控制是决定谷氨酸产量的关键。,（二） 丝氨酸发酵,以C1化合物为唯一碳源的微生物是通过丝氨酸途径来合成细胞组成成分。,C1原料,甲醇,甘氨酸,丝氨酸,磷酸烯醇式丙酮酸,C4二羧酸,合成细胞成分的丝氨酸途径,根据丝氨酸代谢机制，增加丝氨酸产量的关键在于阻断丝氨酸降解为磷酸烯醇式丙酮酸和C4二羧酸的途径。,在生产过程中，可在丝氨酸产生菌

8、生长到一定阶段时，加入8-羟基喹啉、2,2-联吡啶、Co2+、Ni2+,例： 日本的味之素公司的Moringga通过诱变从64，000个菌株中筛选到既是甲醇代谢缺陷的，又是温敏的突变株20株。 在许可温度（30）培养下，该菌具有正常的丝氨酸降解能力，培养48h后，把 温度升高至3840，丝氨酸失去降解作用，因而大量分泌，在添加甘氨酸的培养基中连续培养96h，丝氨酸产量达到6.8mg/mL。,（三）微生物单细胞蛋白的生产,微生物单细胞蛋白质的生产有着很好的前景。 特点：1 底物利用率高，转化快；2 易于被动物消化吸收。,生产单细胞蛋白的菌种的要求,1 含有较高的蛋白质； 2 生长迅速，底物利用率

9、高； 3 菌体细胞壁易碎、易自溶、且细胞易于凝聚沉淀，便于单细胞的分离纯化，也有利于动物的消化吸收。,温敏突变株生产单细胞蛋白质,例1： Miyasaka从若干细胞分裂循环障碍的突变株中，筛选出一株DNA复制缺损的TS4471酵母菌。 该菌在26时，正常生长，而在温度上升到非许可温度37时，细胞形态发生变化，细胞伸长，从母细胞上长出的芽也不脱落，继续培养8h，细胞和芽凝聚成丛状。,例2： Boudrant等筛选到一株在非许可温度下，易于自溶的酵母菌TS186突变株。 该菌株在27时，生长正常，当温度调节到非许可温度37时，连续培养15h，菌体发生自溶，此时释放到胞外的蛋白质含量占细胞总蛋白质含

10、量的30%，而亲株只有2%。,为了提高单细胞蛋白质的营养价值，增加蛋氨酸的含量是其中的一个方面，但是自然界天然蛋白质中蛋氨酸含量都比较低，最高仅有12%。因此如何提高细胞蛋白质中蛋氨酸的含量是专家们研究的课题。,提高蛋氨酸含量的思路,1 在蛋白质转录过程中发生基因突变而达到增加蛋氨酸含量的目的。 也就是说使几种蛋氨酸含量特别低的蛋白质合成被阻遏，或蛋氨酸含量特别高的一种或几种蛋白质被解除阻遏。,提高蛋氨酸含量的思路,2 通过密码子翻译过程中的突变来达到增加蛋氨酸产量的目的。 假如氨基酰-tRNA合成酶的结构发生改变，就可能使tRNA的反密码子除了和mRNA上的相应密码子互配之外，还会和其他密码

11、子配对，或甲硫酰- tRNA合成酶以外的其他氨基酰-tRNA合成酶错误地将蛋氨酸结合到它们的tRNA3末端，使多肽链上掺入大量的氨基酸。,Momose等通过诱变得到了提高蛋氨酸含量的温敏突变株。 同时在探讨机理上，他认为通过密码子翻译过程中的突变，来达到增加蛋氨酸的可能性比较大。,温敏突变株提高细胞蛋白质中蛋氨酸含量,发酵工业中常常应用营养缺陷型作为生产菌株，但它们在发酵过程中，培养基内需要补充生长因子，并且要求严格地控制浓度，要求达到既能满足菌体生长的需要，又要控制加入的量不致引起反馈抑制，即所谓的亚适量。,这在工业生产中是非常麻烦的。如果诱导出合成代谢酶缺损的温敏突变株就可以省去发酵过程中

12、添加生长因子的麻烦了。,第六节 抗噬菌体株的选育,二、噬菌体的分离方法,噬菌体的分离测定方法,双层琼脂法 快速测定法,噬菌斑的形成,噬菌斑的形成，主要是噬菌体感染菌种细胞后，经过繁殖释放出许多子代噬菌体，进一步感染四周细胞，使之裂解死亡，形成一个肉眼可见的空斑。,2 快速测定法,将噬菌体和对数期敏感细胞悬浮液与含有0.50.8%琼脂培养基混合，加到无菌载玻片上摊平凝固，经培养后（数小时），在显微镜或放大镜下观察噬菌斑并计数。根据该法测定金黄色葡萄球菌效价，只需2.54h。,两种方法的比较,两种方法都可以定量地测定噬菌体，准确性也比较高，只是快速测定法较快，双层法比较麻烦，如果只是想知道样品中是

13、否有噬菌体而不做计数要求的话，那么可以把双层法该为单层法。,噬菌体种类不同，形成的噬菌斑也不一致。一般情况下，每种噬菌体形成的噬菌斑的形态是相对稳定的，但有时也随着寄主生理状态、菌龄及培养条件不同而有变化。,三、抗噬菌体菌株的选育,（一）抗性来源,广义地说，微生物细胞由对噬菌体或某种药物的敏感转变为不敏感的特性，都称为抗性。 或细菌的抗性产生于自发突变或人工诱变引起的基因突变，与噬菌体有无无关。,（二）抗噬菌体菌株的选育程序,专一性噬菌体获得和纯化,高效价噬菌体原液的制备,菌株诱发突变,分离在含有噬菌体的平皿上,挑取的抗性菌落和摇瓶筛选,抗性菌株的特性试验,四、抗性菌株的特性研究,抗性菌株的特

14、性,1 抗性菌株稳定性试验 2 抗性菌株的产量性能,抗性菌株稳定性试验,稳定性主要指已选育的菌株对噬菌体的抗性和经过传代后的抗性是否稳定。 抗性菌株要分别移接到含有高浓度噬菌体的斜面培养基、种子培养基和发酵培养基进行培养，用双层法测定，若不出现噬菌斑，说明抗性稳定。 将选育的抗性菌株，连续继代几次，再测定抗性，若不出现噬菌斑，说明抗性稳定。,我们知道，溶源性细胞具有对噬菌体的免疫性，常常会引起对细胞抗性的误会。为此，我们可以采用一些诱变因子处理，使溶源性细胞释放出噬菌体，若不是溶源性细胞则不会释放出噬菌体。,抗性菌株产量的性能,抗性菌株的抗性来自于基因突变，在代谢过程中某些酶的活性必然有所改变，从而使抗性菌株的发酵性能受到影响。,例1：joseph Le