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文档简介
1、.,生 物 制 药 工 艺 学,生 物 制 药 工 艺 学 主讲教师:吴梧桐教授,.,生物制药工艺学主要参考书,1吴梧桐 主编 生物制药工艺学第二版,北京,中国医药科技出 版社,2006. 2王志军 主编生物技术药物研究开发和质量控制,北京,科学出版社,2002. 3吴剑波 微生物制药,北京,化学出版社,2002 . 杂志期刊: 1. 中国抗生素杂志. 2. 药物生物技术. 3. 中国生物工程学报. 4. 中国生化药物杂志. 5. 中国天然药物. 6. 中国医药工业.,.,生物制药工艺学 Biopharmaceutical process,一、学习本课程的目的: 1、培养自己掌握扎实的专业知识
2、,具有创新、创业能力的高素质人才,按联合国科教文组织对世界大学生的要求: (1)Learn to know. (2) Learn to do. (3) Learn to be. (4) Learn to together. 2、培养自己成为药物研究、生产、流通、应用与管理的专门人才。为人民的防病、治病、保健、康复提供疗效好,副作用少,价格便宜,使用方便的生物药物。,.,二、本课程的性质: 是生物技术、生物工程、海洋药学、生化制药、微 生物制药、生物技术制药的专业必修课,也是药学专 业的重要选修课。 三、 本课程研究内容 是从事各类生物药物的研究,生产和制剂工艺过程 的一门综合性应用技术科学。
3、(1)生化与微生物药物制造工艺。 (2)生物技术药物与生物制品制造工艺。 (3)其它生物医药产品(康复保健品)制造工艺。 四、学习任务与要求: (1)掌握制造工艺基本原理及相关基础理论。 (2)熟练制造技术过程及制剂技术。 (3)熟悉生物药物的来源、结构、性质及临床用途。,.,第一章 生物药物概述 Introduction of Biopharmaceutics,1药物 Medicine(remedy) 药物是用于预防、治疗或诊断疾病与调节机体生理功能、促进康复促健的物质,有4大类: (1)预防药物:如疫苗、卡介苗、艾滋病疫苗、SARS疫苗、肿瘤疫苗。 (2)治疗药物:如抗生素、INS、尿激酶
4、。 (3)诊断药物:如肝肾功能检查试剂盒、免疫诊断试剂盒。 (4)康复保健药物:如维生素、氨基酸、叶酸。,.,2药品 Drug 直接用于临床的药物制剂产品,是特殊商品。 药品特点:有固定组成,明确规定有适应症、用法与用量,疗程,并说明可能存在的毒副反应。还规定使用有效期。 药品有3大类:(1)化学药品,(2)生物药品,(3)中药(药材,饮片,中成药)。,.,生物药物 Biopharmaceutics,是以生物材料(生物体、生物组织或其成分:组织、细胞、细胞器、细胞成分、代谢物、排泄物)为原料,综合应用生物学、物理化学与现代药学的原理与方法加工制成的药物。通常有5类: (1)生化药物 Bioch
5、emical medicine (2)微生物药物 Microbial medicine (3)海洋药物 Marine medicine (4)生物制品 Biologics(biologicals) (5)生物医药产品 Biological medicinal products,.,随着生物技术药物的快速发展,现代生物药物已形成4大类: (1)重组DNA药物(包括基因工程和蛋白质工程药物) (2)基因药物genetic medicine(核算类药物,以遗传物质DNA、RNA为治疗物质基础的药物),如核算疫苗、反义药物。 (3)天然生物药物 (4)合成或半合成药物。,.,第一节 生物药物的研究与发
6、展前景,一、生物药物研究发展现状 生物药物的发展已走过传统生物制药技术和工业化生物制药时代,从1982年10月rhIns上市,正式步入现代生物制药阶段。 1、世界现状:已上市200多种生物技术药物,已进入其临床400种;其中200种进入FDA审批,还有700多种进入-期临床,在各个不同临床前研究的有2600多种。,.,二、生物药物的发展与展望,1生物技术药物研究已进入蛋白质工程药物时代 第一代重组药物时代 :一级结构与功能和天然活性蛋白质完全一样; 第二代重组药物时代:对天然产物表达物进行简单修饰,如PEG化或糖基化; 第三代重组药物时代:蛋白质工程药物,在DNA水平上,合理设计、改造、创制新
7、型治疗蛋白。目的: (1)提高活性; (2)减少或消除毒副作用; (3)提高体内外稳定性; (4)产生新的功能特性。 如:快速Ins,B9-SerB9-Asp, B27-Thr B27-Glu 长效Ins, B21-AsnB21-Gly, B-C末端加入2个Arg PI由pH5.4pH6.8,.,2. 中国现状: (1)生产生化药物100多种,抗生素近100种; (2)已批准生物技术药物30多种:如INF-1b,INF-2a,INF2b,INF-,IL-2,IL2-ser125,IL-11,G25F,GM-CSF,-SK,GH,EPO,TPO,EGF,EGF衍生物,bFGF,Ins,TNF衍生
8、物,脑钠素,心钠素,抗IL-8单抗乳膏剂,胸苷激酶基因工程细胞制剂,CHO乙肝疫苗,痢疾疫苗,WuT3单抗(抗CD3CMAb,抗肾移植排斥),131I-chTNT人鼠嵌合型单抗(治肺癌),P53腺病毒抗癌注射剂,葡激酶等,已进入临床的有SARS疫苗,禽流感疫苗,艾滋病疫苗。 中国生物制药企业近代生物制药企业通过GMP的厂家已近200家,年产值400多亿元,仅占全国医药产值7.5%发展空间可观(美国400多亿美元/年),已开始进入自主创新阶段。如:(1)-bFGF(全球首家上市); (2)思凯通(注射SK,1997年上市); (3)注射用重组葡激酶(2003年上市); (4)今又生Gendici
9、ne(P53腺病毒注射剂); (5)TNF衍生物,.,2. 哺乳动物细胞表达产物所占比重快速增加 2000年已批准创新生物技术药物:酵母表达产品2种,E.coli表达产品4种,分子量均在3.5KDa6KDa,表示它表达多肽有优势,而通过动物细胞表达系统22种(包括抗体、酶、凝血因子)如:TNKase(t-pA突变体);(58KDa);AlsuraZyme(laromidase)(58KDa治疗粘多糖病)Fabrazyme (Algasidasebeta,100KDa,治疗Fabrys病) 3. 治疗性抗体发展迅猛 FDA已批准17种治疗性抗体,在抗肿瘤、治疗风湿性关节炎,防止感染、抗血小板凝集
10、等方面疗效突出。在369种进入临床试验的生物技术药物中有75种是抗体类产品,预计2008年会有17种上市。如抗TNF嵌合抗体,TNF-R-Fc融合蛋白。 抗体人源化分为 (1)嵌合抗体:用人源抗体恒定区替换鼠源抗体恒定区,保留抗体可变区。 (2)人源化抗体:可变区中仅CDR(轻链可变区)为鼠源,其FR及恒定区均来自人源。,.,4、干涉RNA(RNAi)RNA interference,是细胞内外源性或内源性双链RNA,可引起与其同源的mRNA特异性降低,抑制基因表达,是抗病毒、抗肿瘤治疗剂的重要设计方向。 5、基因治疗剂:DNA疫苗与基因药物发展迅速,将功能基因与表达载体重组,导入人体细胞,使
11、其在体内表达活性蛋白,产生免疫或治疗作用。已研究成功乳腺癌DNA疫苗(可能对病毒性肿瘤均可获得成功),还有黑色瘤基因治疗也取得突破(使病人晚期肿瘤消失),将病人的T-cell分离出来,用肿瘤抗原受体基因改造T-cell,再注入人体,可以对黑色素瘤产生有效清除作用。,.,第二节 生物药物的性质与类别,一、生物药物的特性 (Characterization of Biopharmaceutics) (一)生物学特性: 1、组成、结构与天然活性物质一致,是生物进化与自然选择 的结果。 2、具有调节、控制生物功能,战胜疾病的物质基础。 3、对人体进行补充、调整、增强、抑制,替换或纠正代谢失调更为合理和
12、有效。 4、活性强,毒副作用一般较少,针对性强,疗效确切,还有营养作用。 5、是创新药物的优良先导物,通过分子设计可以研制新型有效药物,如从抑长素研制环己肽(环6肽)。 28肽 环6肽 Pro-Phe-D-Trp Pe-Thr-Lys,.,(二)、化学特性: (1)含量低、杂质多、工艺复杂、收率低、技术要求高; (2)组成结构复杂,具严格空间结构,才有生物活性。对多种物理、化学、生物学因素不稳定,故研究时要执行GLP规范,生产时要求GMP管理。 (3)活性高,有效剂量小,对制品的有效性,安全性要严格要求(包括标准品的制订)。,.,二、生物药物的类别:共分4大类 (一)天然生物药物 1微生物药物
13、 microbil medicine 由微生物产生的生理活性物质:包括初级及次级代谢产物和转化产物。 (1)抗生素:抗菌、抗肿瘤抗生素,如青霉素,链霉素,红霉素,四环素,多粘菌素,两性霉素B,氯霉素,利福霉素,磷霉素等。 (2)酶抑制剂:如克拉维酸,-内酰胺酶抑制剂(青霉素增效剂) (3)免疫抑制剂:如环孢霉素A,.,2生化药物(含海洋药物):Bio chemical medicine 用生物化学的原理与技术从动植物、海洋生物和微生物制取的生化活性物质。 (1)氨基酸类药物 amino Acid 如胱AA、色氨酸、精氨酸等。 (2)多肽类药物 Poly peptide如缩宫素、加压素等。 (3
14、)蛋白质类药物 如人血白蛋白,r-球蛋白 (4)酶类药物 如胃蛋白酶,尿激酶 (5)辅酶类药物 如CoQ10,CoASH (6)核苷酸与核酸类药物 如RNA注射液:PolyI:C (7)多糖类药物(polysaccharide):如肝素、玻璃酸。 (8)脂类药物:如去氢胆酸,胆红素、PGE1、PGE2。,.,(二)生物技术药物(新生物制品)Biotech-drugs 1. DNA重组药物(DNA recombinant medicine)基因工程与蛋白质工程药物 (1)细胞因子干扰素类药物:IFN,IFN-,IFN (2)细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子:IL-2,IL-6,IL-11;TNF-
15、,TNF -R (3)造血系统生长因子类: G-CSF,GM-CSF,EPO,TPO,SCF (4)重组蛋白和多肽类激素药物:Ins,rHGH,FSH,LH,HCG (5)生长因子类药物:EGF,PDGE,TGF,NGF (6)心血管病治疗剂与酶制剂:水蛭素,t-PA,尿激酶,门冬酰胺酶 (7)重组蛋白疫苗与基因工程治疗性抗体:乙肝疫苗、丙肝疫苗、对淋巴瘤CD3单抗(OKT3)抗排斥。HER-2(表皮生长因子受体抗体),抗乳腺癌转移(人源化抗体),.,2. 基因药物(核酸类药物) (1)核酸疫苗:将目的基因与表达载体构建成重组体导入人体,使其表达免疫蛋白,呈递免疫应答,如乳腺癌疫苗。 (2)反
16、义药物ISIS2900,用于治疗巨细胞病毒性视网膜炎。 (三)合成或半合成生物药物: 如催产素,降钙素,PEG-腺苷脱氨酶,PEG-门冬酰胺酶,.,第二章 生物制药工艺技术基础 Basis of biopharmaceutical technology 第一节 微生物制药工艺技术基础,一、菌种的选育与保芷 1自然选育 是一种纯种选育方法,依据自发突变原理,通过不断分离筛选,除去衰变型菌落,选择高产菌,达到强化、复壮、稳定生产目的。 操作:单孢子悬浮液分离及单菌落培养筛选 纯培养:从一个单细胞微生物取得的后代培养称纯培养 方法:(1)平板划线法 (2)稀释平板法,.,2诱变育种 (1)诱变处理:
17、化学诱变;物理诱变 (2)代谢调节选育 (3)基因重组技术改变代谢途径 (4)原生质体融合 突变株筛选一般进程如图所示 第三第四轮同第二轮,.,3菌种保存,(1)保存目的:防止退化 (2)菌种退化检查方法 (3)菌种退化防止方法 (4)菌种保芷方法:斜面低温保存 4,湿度105倍) 已有高温DNA聚合酶,故操作已自动化(PCR仪) (3)化学合成法 在已知DNA序列或多肽的一般结构时,如链长在 60bp100bp可用化学合成法直接合成DNA。,.,2DNA重组体的构建 将目的基因与基因载体连接,构成重组体 基因载体(Vector)有 (1)E.coli载体 如PBR322(非表达型载体) 表达
18、型:PUC质粒,PKK233-3,P ET系统:PET28a,PET32 (2)芽孢杆菌载体 如PUB110 pE194和pC194 (3)链霉菌载体 如PIJ101 PSG5 (4)噬菌体载体 如gt10(非表达型) gt11(表达型) *非表达型用于构建克隆基因扩增与鉴定, 表达型用于构建生产目的蛋白的工程菌。 一般目的基因10Kb,可选用噬菌体DNA为载体。,.,cDNA与载体连接方法 同聚尾连接法 用3-脱氧核苷末端转移酶,使cDNA与载体DNA3末端带上互补同型多聚体序列: 如质粒-poly-C(或A) cDNA-poly-G(或T) 两者退火后,经T4DNA连接酶封口,构建重组体。
19、,3脱氧核苷转移酶 cDNA cDNA-polyA(C ) dNTP 载体DNA-polyT(G) 人工接头连接法 用T4DNA连接酶在平端上连接上人工接头,再用工具酶切开成粘性末端。 目的基因 + cDNA 接头 工具酶(内限性内切酶),.,3重组体的表达系统 表达方式常用有胞浆内表达 分泌表达 周质表达 (1)原核表达系统 E.coli;芽孢杆菌Bacillus;链霉菌Streptomyces E.coli表达系统的优点:易大量生产,成本低,周期短,相对较安全,已公认可供大量生产。 缺点:多为胞内表达、纯化困难,易生成包含体,复性困难,产物多为AuG(Met)起始密码, 有内毒素污染的可能
20、。,.,(2)真核表达系统 1) 酵母 属单细胞真核生物 非分泌型载体如PA815,PPIc2,分泌型PHIL-S1 优点:易培养无毒性可分泌表达产物可糖基化 常用酵母表达体系酿酒酵母(Saccharomyces coeviviae) 表达,毕赤酵母(pichia psatoris) 特点:启动子为AOX1,属乙醇氧化酶I基因,受甲醇诱导 易高密度发酵,达100g/L(10%) 已成功用于表达INF,乙肝表面抗原疫苗,Ins,Aibumin 2)动物细胞表达体系 A哺乳动物细胞CHO(病毒质粒为载体) B昆虫细胞家蚕细胞,如生产INF,.,4表达与表达产物的纯化 (1)选择高效表达工程菌,优化
21、发酵条件(培养基组成,接种量,温度,溶氧,pH,诱导作用,发酵动力学)进行扩大发酵. (2)分离纯化要求: 技术条件要温和 选择性要高 收率要高 步骤要少,时间短E纯度95%。,.,表达产物流程 *inclusion bodies 由表达产物重组蛋白,宿主蛋白和膜蛋白组成,以表达产物为主,其一级结构正确,但空间结构错误,没有活性,不溶于水,可低速离心收集包涵体,用变性剂SDS尿素,盐酸胍溶解,再稀释透析除去变性剂,使其复性。,.,为防止或减少包含体的形成常用方法: (1)降低培养温度 从37降到30可显著降低包含体形成率。 (2)以硫氧还原蛋白为载体进行融合表达。 硫氧还原蛋白是E.coil的
22、一种同源蛋白,定位于粘附区,富含-SH,可保目的蛋白不发生分子错误折叠,是一种热稳定蛋白,表达产物聚集于粘附区,通过振扰提取使产物进入介质中,再酶解就得到目的蛋白。,.,二、酶工程制药技术基础 1、什么是酶工程 (1)酶的发现,分离,纯化与酶制剂的工业化应用。 (2)酶与细胞的固定化技术与酶反应器。 (3)生物酶工程:以基因工程技术和蛋白质工程技术研究酶工程。 (4)酶工程技术的工业化应用。 2、优点 (1)固定化稳定性提高 (2)可重复使用,提高使用效率,降低成本 (3)提高强度,便于连续化,自动化,规模化生产 (4)便于产物的分离、纯化,.,3、制备方法: 吸附法,包埋法、共价键结合法 、
23、 交联法 (1)包埋法:将酶或细胞定位于凝胶高聚物网络中,如卡拉胶,海藻胶,聚丙烯酰胺 如用卡拉胶固定L-苹果酸合成酶生产L-苹果酸,卡拉胶加水(加热)溶解成5%(冷却40)加入产酶菌体(搅拌均匀)冷却(冷冻)切块(1-2CM2)KCl固化装柱 (2)共价键结合法:酶分子与载体分子,通过化学偶联使酶与载体共价结合,一般纯酶固定化,用此法适用批量小,附加值高的产品生产。如用CNBr活化纤维素载体再与酶蛋白共价结合。 利用固定化胰蛋白酶亲和层析制备胰蛋白酶抑制剂 (3)交联法:用双功能试剂,将酶与载体交联固定化 如用二醛和明胶交联固定化前列腺素合成酶合成PGE1,PGE2,.,4 固定化酶性质:
24、(1)通过固定化酶活一般下降,因酶的空间结构发生变化,或酶与底物结合时有空间位阻,因此要测定固定化酶的表现活力,再计算总活力,并与使用半衰期的延长时间,统计分析固定化工艺的有效性 (2)提高稳定性,因固定化酶表现活力下降,但稳定性提高,因此其稳定性和测定对评价工艺效益十分重要,半衰期t1/2=0.693KD KD=2.303lg(ED) /(E) 为起始活力,E为时间t后残留活力。故常常要研究E的操作,储存稳定性或对pH对热的稳定性和对蛋白酶的稳定性。通过E一般可以提高稳定性(包括对温度,pH,蛋白酶,变性剂和抑制剂的耐受程度)因此有利工业化的连续化与自动化应用。所以在生物工艺中就得到广泛应用
25、。如制造r-氨基丁酸,天冬氨酸,L-苹果酸,丙氨酸,色氨酸,苯丙氨酸等。还用于从丙烯氰生产丙烯酰胺,.,第四节 生物制药工艺中试放大设计 一、中试放大目的与规模 1目的:(1)建立稳定工艺、大批量制备足量合格产品,供应临床前与临床研究; (2)研究工艺参数制定工艺规程和检定规程,为正式生产提供工艺参数,保证能在以后生产中应用。 二、规模: 中试是由小试转入工业化生产的过渡性研究,是取得成功产业化的关键。,.,三、中试放大特点 1、改进小试操作,稳定工艺 2、提高收率,提高产品质量 3、降低消耗,确定原辅料质控标准 4、形成批量生产,制定制造规程和检定规程 四、中试放大时应具备的条件 (1)有稳
26、定的工艺:收率,质量可靠 (2)操作条件基本确立 (3)已建立中间品和成品分析方法 (4)生物材料已鉴定 (5)物料平衡、三废处理已基本解决 (6)中试规模、产品产量,规模已确定 (7)安全生产已有方案,.,五中试放大要解决的问题 (1)原辅材料规格 (2)设备选型与材质选用 (3)反应条件 (4)原辅料中间品、产品质控标准与检定方法 (5)下游工艺优化与稳定制造规程的制定 六中试放大方法与总结内容 1、放大方法(1)经验放大 (2)相似放大 (3)数学模型放大 2、总结内容: (1)确定工艺路线,优化工艺条件,制定制造规程。 (2)制定岗位操作、投产 (3)进行材料衡算 (4)安全生产与处理 (5)原辅料及产品质控方法与标准测定。 (6)产品规格标准制定 (7)消耗定额,成本核算,工时,生产周期计算。 中试完成进行总
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