抗菌药物敏感试验完整ppt课件

1、.,1,抗菌药物敏感性概述 抗菌药物敏感性试验方法 全国“细菌耐药监测网”简介,.,2,敏感和耐药的概念,从本质上讲：细菌对某种抗菌药物是敏感还是耐药，常以该抗菌药物的治疗浓度与MIC的关系而定。,常用剂量的抗菌药物通过常用途径所能达到的血药浓度,.,3,血药浓度与MIC之间的关系,敏感,中介耐药,耐药,上限,下限,.,4,抗菌药物的治疗浓度与MIC的关系： 若MIC小于治疗浓度， 则为“敏感”（Sensitive , S ），推荐使用。 若MIC大于治疗浓度， 则为“耐药”（ Resistant , R ）； 若MIC介于治疗浓度的上下限之间， 则为“中度耐药”（ Intermediate

2、, I ）或中度敏感,敏感和耐药的概念,.,5,.,6,敏感,治疗浓度的上限 即表中的 R,治疗浓度的下限 即表中的 S,耐药,中介耐药,治疗浓度,CLSI标准,MIC,.,7,第一节、抗菌药物敏感性试验方法,需氧和兼性厌氧菌,.,8,稀释法 肉汤稀释法（试管稀释法） 琼脂稀释法（平板稀释法） 纸片扩散法（纸片法） E-试验 联合药物敏感试验,需氧和兼性厌氧菌药敏试验的方法,.,9,稀释法的特点,定量的药敏试验，测定MIC、MBC。 方法比较繁琐，手工操作一般不作为常规试验，常用于调查罕见耐药。 自动微生物鉴定药敏分析系统采用微量稀释法检测MIC。,.,10,二、纸片扩散法（disc diff

3、usion test) （Kirby-Bauer法）,原理： 将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有测试菌的琼脂平板上。抗菌药物向琼脂四周扩散形成递减的梯度浓度。 药物敏感细菌在纸片周围一定距离内的生长受到抑制，形成抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌 对药物的敏感程度。 二者呈正相关。,.,11,抑菌圈边缘的药物浓度 与 MIC,.,12,抑菌圈的大小与MIC： 二者呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。,.,13,纸片法药敏试验抑菌圈直径与结果解释的标准,.,14,操作方法 ： 1. 制备M-H琼脂平板，厚度4mm。 2 .制备0.5麦氏比浊管浊度的菌液 （培养1624h，45个菌落）。 3. 菌液均匀涂

4、布于平板。（15分钟接种完毕） 4. 无菌贴标准抗生素纸片于M-H琼脂表面， 5. 经过351624h孵育。 6. 量取抑菌环直径， 根据CLSI标准， 报告细菌对该抗生素敏感、 耐药、中介。,.,15,操作方法 ： 1. 将在约56恒温的无菌M-H琼脂倾注直径为90mm 的平板，其厚度 4mm。,.,16,2.无菌挑取孵育1624h的血平板上45个菌落。,.,17,3. 将菌置于无菌生理盐水中，校正其浊度于0.5麦氏比浊管浊度的菌液。,1.5108CFU /ml,.,18,4.用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向均匀抹琼脂表面（每次转60）使菌液

5、均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。,.,19,5.盖上平板的盖子，放置培养箱内孵育，放置310分钟后贴上标准抗生素纸片。,.,20,6.用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于M-H琼脂的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中 心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。,.,21,7.经过351624h孵育。,8.取抑菌环直径， 根据CLSI标准，报告细菌对该抗生素敏感、耐药、中介。,.,22,纸片扩散法质量控制,培养基：M-H平板厚度，4 mm 细菌悬液：0.5麦氏标准的细菌浓度 药敏纸片的质量 各抗菌纸片中心距离应大于24mm， 纸片距平板内缘应大于15mm。 9cm的平板贴6

6、个 培养时间 质控菌株,抑菌圈直径？,.,23,.,24,根据抑菌圈的直径，依照CLSI标准，作出敏感、耐药、和中介的判断。为 定性”结果。 CLSI推荐的最简单的药敏试验。,纸片扩散法的特点,.,25,三、E试验法（浓度梯度法）,原理： E试条是一条5mm50mm无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的浓度呈连续指数增长的抗菌药物，另一面有判别的刻度。抗菌药物的梯度可覆盖有15-20个对倍稀释浓度的宽度范围。 将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的MIC。 依照CLSI标准判断其敏感、耐药、中介。,256

7、128 8 016,.,26,无菌生长区,有菌生长区,.,27,椭圆形细菌生长抑制区,256 128 8 016,判读抑菌浓度 （MIC ug/ml),.,28,.,29,.,30,E test 法特点,优点 连续浓度梯度，与琼脂稀释法相关性好（相关系数为0.9）.可测MIC。 操作简单，影响因素少，稳定性高。 缺点：E试条较昂贵; 不适用于生长缓慢的苛养菌。,.,31,用于病原菌尚未确定的急、重症感染的经验治疗,以扩大病原治疗的覆盖面 治疗多种细菌所引起的混合感染 对于某些耐药菌可取得协同抗菌作用 减少或推迟治疗过程中细菌耐药性的产生 避免药物达到毒性剂量。,四、联合药物敏感试验,联合药物意

8、义,.,32,增强作用：两种抗生素联用的效果大于它们单独使用时的效果之和； 2025 相加作用：它们联用时的效果等于单用两种抗生素效果之和； 6070 无关作用：两种抗生素联用的效果，仅相当于其中一种具有较强作用的抗生素的效果； 拮抗作用：两种抗生素联用时的效果反而小于它们分别使用时的效果之和。 1015,两种药物的联合使用的效果,.,33,两种抗菌药物作用部位不同： 内酰胺类抗生素（抑制细菌细胞壁合成）与氨基糖苷类抗生素（干扰细菌的代谢）。 增强作用：增加了药物进入细菌细胞 杆菌肽（降低细胞通透性）与氨基糖苷类药物（干扰细菌的代谢）。 拮抗作用：降低了药物进入细菌细胞,抗菌药物协同作用发生原

9、理,.,34,棋盘稀释法 利用肉汤稀释法原理，依据两种药物的MIC， 以棋盘设计两种药物不同浓度的组合。 计算抑菌浓度指数（fraction inhaibitory concentration,FIC),联合药物敏感试验方法,.,35,棋盘稀释法,首先分别测定拟联合的抗菌药物对检测菌的MIC。 药物最高浓度为MIC的2倍，对倍稀释。 两种药物的稀释分别在方阵的纵列和横列进行，这样在每管（孔）中可得到不同浓度组合的两种药物混合液。 接种菌量为5105CUFml，35孵育18h后观察结果。 计算部分抑菌浓度（FIC）指数。,.,36,抑菌浓度指数（FIC）,FIC ,A药联合时的MIC,A药单测的

10、MIC,B药联合时的MIC,B药单测的MIC,FIC 0.5为协同作用； 0.51为相加作用； 12为无关作用； 2 为拮抗作用,.,37,A药： 32 16 8 4,B药: 16 8 4 2,生长,生长,生长,生长,生长,生长,生长,生长,生长,生长,生 长,.,38,药敏试验方法的比较,K-B法： WTO推荐使用的最简单的定性药敏试验。 稀释法：准确测定MIC、 MBC，比较繁琐， 试管法一般不作为常规试验。 微生物自动分析系统采用微量稀释法原理。 E试验：可测定MIC。,.,39,第二节 结核分枝杆菌的药敏试验 （了解）,首次分离的分枝杆菌需做药敏试验，有助于合理用药和监测药物敏感性。

11、另外经过三个月正规治疗，标本分离培养仍为阳性患者，或感染的严重疾患（如播散性结核病和结核性脑膜炎）。 以及来自高耐药流行区的患者，均须做体外药敏试验。,.,40,四种方法,比例法 放射同位素法 绝对浓度法 耐药率法,直接法：直接采用图片阳性的体液标本。（须经充分消化五杂菌） 间接法：经分离纯培养后的次代培养菌。,.,41,无药,药2,药3,药1,Middlebrook7H10琼脂 培养3周,间接比例法（WHO推荐）,敏感：含药格无结核杆菌生长， 或菌落数1%对照格 耐药：含药格菌落数1%对照格。,不含药的对照格菌落数应为50150,4 格平板,.,42,分枝杆菌微量直视 快速药敏试验法,400

12、0 倍,.,43,培养72h观察结果,INH敏感,RFP耐药,阳性对照,阴性对照,.,44,第三节 厌氧菌体外药敏试验 （了解）,厌氧菌感染多为内源性感染，厌氧菌药物敏感性稳定，一般不做体外药敏试验。 下述情况应考虑药敏试验： 明确厌氧菌引起的严重感染； 已确证的厌氧菌感染，经验性选药治疗未能奏效； 需长期用药的厌氧菌感染。,.,45,基本原理和方法与需氧菌相同，只是在培养基、操作环境和培养条件等应根据厌氧菌的特定需要变动。 培养基为布氏血琼脂再加人补充剂 5g/ml氯化血红素，5脱纤维羊,1g/ml Vit K。 厌氧孵育条件 质控菌株为脆弱类杆菌ATCC25285。,厌氧菌体外药敏试验,.

13、,46,药敏试验结果的临床价值,影响抗菌药物临床疗效的因素很多，据报道药敏试验结果与临床疗效的符合率约为70% ， 因此细菌培养及药敏试验报告只能作为临床用药的参考，应根据患者用药后的治疗反应和临床病情及时调整用药。 医学检验的灵魂是与临床沟通。,.,47,新的药敏试验方法探索,流式细胞术检测抗生素最低抑菌浓度 分枝杆菌药物最低抑菌浓度的快速测定方法研究,.,48,细菌耐药性的发生过程：,细菌获得与耐药相关的基因 编码与耐药有关的蛋白 表现出对某种抗生素的耐药,基因：537 表型：书533页 敏感性,.,49,第35章第三节 细菌耐药性检测,.,50,生物化学技术检测酶的等电点(等电聚焦电泳)

14、 头孢哨噻吩滤纸片法 碘淀粉测定法 分析酶的底物谱及抑制物谱 纸片法和稀释法,1、-内酰胺酶检测,临床意义：产ESBL克雷伯菌和大肠埃希菌对青霉素、头孢菌素和氨曲南治疗无效。,一、耐药表型检测,.,51,G-菌产生的头孢菌素酶检测 -头孢哨噻吩滤纸片法,用接种环挑取受试菌于头孢哨噻吩（产色头孢菌素）滤纸片上(商品化)， 10分钟内由浅黄色转变为粉红色即阳性结果， 表示头孢菌素的-内酰胺环被酶打开。 临床意义：产生该酶的细菌对头孢菌素类抗生素耐药。,.,52,G+菌产生的青霉素酶检测 -碘淀粉测定法,受试菌混于青霉素溶液，振摇30分钟。加入淀粉液后，再加入碘液，溶液变蓝，继续振摇。 10分钟之内

15、蓝色消失者为产酶株。,青霉素酶,青霉素,青霉素噻唑酸,碘,碘淀粉复合物变为无色,多为金黄色葡萄球菌产生，对青霉素G耐药。,.,53,超广谱-内酰胺酶 Extended-Spectyum-Lactamase，ESBL ESBLs,能水解青霉素类，头孢菌素和氨曲南。 不能水解碳青烯酶类，如亚胺培南 多数可被内酰胺酶抑制剂（如克拉维酸，三唑巴坦及舒巴坦）所抑制。 如为ESBL阳性，则对青霉素类，头孢菌素和氨曲南均报告耐药，不考虑体外药敏结果。,.,54,常见产ESBLs菌株,最常见是肠杆菌科细菌（大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌）； 其次，阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、弗劳地枸橼酸菌、铜绿假单胞菌、奈瑟菌等

16、。,.,55,ESBLs的临床意义,对产ESBLs菌株，目前最有效的抗生素为碳青霉烯类（泰能），其次，头孢西丁及含酶抑制剂的复合剂、氨基糖甙类部分有效。 若临床出现产ESBLs菌株，会在病人和医院之间及不同菌株间相互传播，应引起充分的重视。,.,56,纸片初筛： 培养基：Muller-Hinton琼脂 药敏纸片 接种：按标准纸片扩散法 孵育： 35大气环境，16-18小时 结果： 头孢泊肟（10ug片）抑菌环22mm 头孢他啶（10ug片）抑菌环22mm 氨曲南 （30ug片）抑菌环27mm 头孢噻肟（30ug片）抑菌环27mm 头孢曲松（30ug片）抑菌环25mm,超-内酰胺酶检测纸片扩散法

17、,ESBLs的底物,可能产生ESBLs,.,57,培养基：Muller-Hinton琼脂 药敏纸片浓度： 头孢噻肟30ug、头孢噻肟/克拉维酸30ug/10ug 头孢他啶30ug、头孢他啶/克拉维酸30ug/10ug 接种：按标准纸片扩散法 孵育：35大气环境，16-18小时 结果：复合制剂药物纸片的抑菌圈直径 比非复合制剂药物纸片的直径 5mm 以上者为产ESBLs菌。,ESBLs的底物 ESBLs的抑制剂,(1)纸片确证试验：,.,58,混合克拉维酸药物纸片,无克拉维酸药物纸片的直径,直径差5 mm ：ESBL,.,59,筛选试验： 选用头孢泊肟、头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟或头孢曲松至少2

18、种以上， 用标准肉汤稀释法稀释至1g/ml, 凡被测菌在上述各管中能够生长(MIC2g/ml)，高度怀疑为ESBLs，应进一步作确认试验来加以确诊。,（2）液体稀释法,.,60,确认试验： 用标准肉汤稀释法测定MIC的方法, 头孢噻肟单独稀释(0.2564g/ml)及 头孢噻肟(稀释范围相同)加克拉维酸(每管4g/ml); 头孢他啶单独稀释(0.25128g/ml)及 头孢他啶加克拉维酸(每管4g/ml), 上述2种药物必须同时进行试验, 结果加克拉维酸和不加克拉维酸的 MIC差值8倍(3个稀释度)，可确认为ESBLs菌株。,（2）液体稀释法,.,61,二、细菌耐药基因检测,基因检测方法检测细

19、菌耐药性的优缺点 抗生素耐药性的基因检测方法 基因检测方法的应用,.,62,基因检测细菌耐药性的优点：,能早期指导临床医生治疗用药。 分子遗传学方法可以直接从临床标本入手，无需菌株的培养，极大地节省时间 ， 减轻实验室生物危险性。 有助鉴别那些处于中介水平或常规药敏结果模棱两可的结果。分子生物学方法被认为是“ 金标准” 。 在细菌耐药性的流行病追踪调研中，耐药基因检测比抗生素敏感方法更准确。 发现新的耐药基因。,.,63,基因检测方法检测抗生素耐药性的缺点：,当样品中菌量很少时，其敏感性会大大降低。 对每一个测试的抗菌药物，均需要设计相应的分子检测方法，一次只能检测一种耐药机制。 目前仍有许多

20、耐药机制是未知的，无法进行分子检测。 耐药基因的检测也会存在假阳性问题。 对许多耐药基因的检测方法，目前还缺乏临床对照研究以评价其准确性、重复性及临床应用价值。,.,64,常见的细菌耐药相关基因举例,.,65,耐药基因检测方法：,分子方法检测耐药基因的基础是 PCR。 在 PCR基础上发展的方法： 分子杂交、 DNA序列分析， 基因微振列技术等。,.,66,PCR-序列特异性引物扩增耐药基因,标 本,提取DNA,PCR扩增目的基因DNA,琼脂糖凝胶电泳,结果分析,1 2 3 4,1 2 3 4,耐药基因的的特异性引物,理想的靶序列应当是耐药基因的编码区域，而非编码区外的基因( 如插入序列或启动子序列) 。 特异性高，需要设立阴性对照。,.,67,基因芯片技术,芯片制备：以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。 样品制备：生物样品往往是复杂的生物分子混合体，须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。 杂交反应：即荧光标记的样品与芯片上的探针进行反应产生一系