核酸检测ppt课件

1、.核酸检查在血液检查中的应用、深圳市血液中心、血液检查是否需要核酸检查、无偿献血的新动向，“定期无偿献血者是低危险献血者”，而“以健康检查为目的的定期无偿献血者是高风险献血者”，其中一部分人的献血队伍在扩大。 这部分人靠窗的概率比其他人高。 因为他们之间高风险的传播很频繁。 治疗后的HBsAg变为阴性，ELISA法检查阴性的献血者。 NAT和ELISA互补，病毒变异免疫沉默期的实验操作错误病毒感染的窗口期、病毒检测窗口期、血液筛用NAT试剂和临床用的差异、目的和要求不同，定性和定量临床用核酸检测的主要目的是定量监测，进行疗效分析。 血筛是病原体的定性筛选灵敏度和特异性临床上在漏检和误差之间重视

2、误差血液筛选用核酸的目的是保证血液安全，重视漏检的要求不同的临床和筛选血液的要求也不同。 临床试剂以定量准确、防止误报为质量管理目标，以防止漏检为主要目的的阳性率也不同，临床上更多阳性的血筛在阴性、自动化要求不同的临床上更多地被患者使用，一个人检查，标本量少的血筛被正常人使用，因此检查量不同，自动化要求也不同血筛用NAT平台的要求，灵敏度HBV10IU/ml； 虽然HCV、HIV200IU/ml的特异性核酸特异性较高，几乎没有学习假阳性的方法，但为了防止污染内标(内对照)，各管的阳性质量管理自动化要求大规模、高吞吐量。 对于灵敏度的一些问题，厂家宣传的灵敏度指单独测定的非推荐pooling方案

3、的实测灵敏度只能用实用灵敏度=宣传灵敏度pooling数IU来比较： WHO标准品和国家一级标准品由于IU单位HCV、HIV窗期浓度高，对灵敏度的要求低。 由于美国FDA要求HCV、HIV5000IU/ml在轮询方案中检测到的HBV窗口标本在30-300IU/ml之间，灵敏度要求在高度上也可能低于灵敏度，这与采样概率有关，经常用于血液筛选核酸提取均使用串珠法提取磁珠的原理：在磁珠中特异性地吸附核酸的物质，通过磁分离技术从分解液中提取病毒核酸的工序：分解吸附洗涤洗出的优点：磁珠提取的特异性高，标本因素影响小，灵敏度高完全手工工作量过大，在实时荧光定量PCR技术的原理下，实时荧光定量PCR是指通过

4、实时检测PCR放大反应中各个循环产物的荧光信号，实现起始模板的定量和定性分析。 在实时荧光定量PCR反应中引入了荧光光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应生成物累积，荧光信号强度也成比例增加。 可以在每一个周期收集荧光强度信号，以根据荧光强度的变化监视生成物的量的变化，得到荧光放大曲线图。实时荧光的优点、特异性好的引物、探针的双重保证特异性方法学假阳性的扩增检测很少同时进行，速度快，不处理扩增产物，荧光检测灵敏度高的罗氏第二代NAT试剂也使用了实时荧光检测，内标设计原理， 内标是与模板放大效率相似的低含量DNA片段，放入PCR反应液中，与模板一起放大，反应每根管的真正放大情况，如果内标和

5、样品未放大，表示该管的放大无效，应该重新开始、内标的作用：避免假阴性，内标的种类：相同，异源内标的作用：真正的反应扩增效率避免假阴性：假阴性是目前血液筛查中最重要的问题之一，内标进行质量监测的质量控制。 核酸检测中遇到的问题和解决办法。人员的素质和清洁很重要，血液筛用NAT对低浓度的要求太高，高灵敏度的试剂操作对人员很高，同一平台的不同实验员有很大差异。 平台成立初期存在很大问题，人员素质要求与自动化程度成反比的实验室和仪器清洁由于高浓度标本少，不易引起大面积污染。 但由于试剂灵敏度高，不随时注意清洁，污染就会有积累效果，引起散发性样品污染，引起假阳性，采血样品管的处理，玻璃容器在使用前必须在

6、高压下处理。 玻璃容器中经常含有不易失活的RNA酶。 最好是热灭菌，在250下烤4小时以上，RNA酶就会永久失活。 异硫氰酸盐(Guanidine thiocyanate，GITC )使DNA酶和RNA酶立即失活。 收集标本，利用STAR工作台制作汇集软件。 合理的轮询方案、轮询方案、灵敏度要素与血液中最低病毒含量和标本收集数成比例的成本要素的试剂价格是以test为单位，检测单位的成本是与轮询方案有关的样品量和检测时间要素的增量=提取量3(HBV、HIV、HCV )是仪器影响灵敏度因素的轮询方案内目标浓度标本的样品量珠量和混合模板制作过程的损失和提取量，批次质量控制的选择和设定，使用低浓度样品

7、进行批次阳性质量控制有内标，因此批次阳性质量控制的主要目的是监视实验精细的系统误差。 因此，阳性质量控制浓度选择过低的质量控制会影响工作，所以不能使用比最低灵敏度浓度推荐灵敏度多35倍的阳性和阴性质量控制来固定位置。 由于随机分布有内标，多阳性质量控制偶有个别问题，实验结果也得到保证。 内标和结果的判定，内对照(IC )保证质量控制在每个管质量控制中使用双荧光的内部对照和样品反应条件绝对一致的竞争设计，保证影响因素一致的结果判断原则：样品检测阳性，未诊断的IC状况阳性样品检测阴性：内部对照阳性， 可以报告阴性结果的内部对照阴性，复查需要用软件自动判断，建议人工研究，在核酸实验室管理软件、实验室

8、管理软件中添加核酸检查的管理模块，实现计算机管理、检查结果的自动控制。NAT和ELISA检测的合作，1同步检测2首先进行常规检测，进行核酸检测，自动化要求、质量核酸检测技术要求高，特别是血筛用灵敏度要求高，所以自动化保证质量的连续性进入计算机管理系统，标本多，所以也进行轮询。 为了便于管理和减少人为错误，优选使用全自动工作站。 像这样轮询号、标本号被统一地自动记录，不容易错误地提高工作效率，降低工作强度，缩短实验时间。 自动化的过程。今后面临的问题。 降低检验成本、降低实验室建设成本的人工费管理成本设备成本(各厂家设备是否兼容，试剂销路好)试剂成本的质量成本，进行合理的集中检验，提高检验成本集中的区域必须考虑标本的运输时间标本处理、标本样品和处理：也是核酸检测质量管理体系的重要一环，否则，检测前病毒核酸会分解，成为假阴性检测结果。 临床基因扩增检验实验室工作规范临床上用于RNA (如HCV RNA )扩增检测的血液标本提出抗凝处理，尽快(3小时内)分离血浆避免RNA分解。 如果进行抗凝固处理，采血后1小时内必须分离血清。 用于全国艾滋病检测技术规范核酸定性检测时，采集的抗凝固全血必须在48h内分离PBMC和血