实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳

1、实验五 DNA限制性酶切和 琼脂糖凝胶电泳,限制性内切酶,EcoR I Restriction Enzyme,识别序列： -GAATT C - - C TTAAG -,BamH I Restriction Enzyme,识别序列： - GGATC C - - C CTAGG -,Hind III Restriction Enzyme,识别序列： - AAGCT T - - T TCGAA -,每一种限制性内切酶都有特定的反应条件： pH范围： 7.58.0 缓冲液组份: Tris(三羟甲基氨基甲烷）、 NaCl、 MgCl2、 巯基试剂（巯基乙醇、二硫苏糖醇） 温育温度：37,反应体系： DN

2、A (1ug或更少) 5ul 10 x Buffer 2ul Restriction Enzyme 3ul H2O 10ul Total 20ul 混匀，37度保温30分钟,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳是一种简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。,电 泳,在一个电场的作用下，在某种支持介质上，能将一个混合物分离成若干条区带（若干个组分）的过程。,电泳法的优点,凡是能带电的物质，都可以用电泳法分离。 样品用量少。 设备简单。 可在室温进行。 操作简便，费时不多 不同类型的电泳，有不同的用途。 改进或找到更好的支持介质，就有可能大大地提高分辩率。,琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂糖粉末

3、加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。,琼脂糖,琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围,试剂,TBE电泳缓冲液 45mmol/L Tris-硼酸，1mmol/L EDTA，pH 8.0 加样缓冲液 0.25%溴酚蓝，40%蔗糖 EB（溴化乙锭）染色液（有毒） 1ug /ml，用1TBE配制,Blue / Orange 6 x Loading Dye,组成 10% Ficoll 400 0.25% bromophenol blue（深蓝色） 0.25% xylene cyanlo FF （天蓝色） 0.4% orange G （黄色） 10mol/L Tirs-HCl (pH7.5), 50mo

4、l/L EDTA 使用量 5份DNA溶液加1份Blue / Orange 6xLoading Dye,溴化乙锭(ethidium bromide，EB),EB是一种荧光染料，其扁平分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。 在电泳后，将凝胶浸入浓度为 0.5ug/ml的EB溶液中染色1015min。琼脂糖凝胶经EB染色后，在紫外光照射下，可见核酸电泳带，DNA量一般5ng。,操作步骤,酶切反应,反应体系： DNA 5ul 10 x Buffer 2ul Hind III 3ul H2O 10ul Total 20ul 混匀，37度保温30分钟,电泳前的准备工作,制胶,上样和

5、电泳,染色和成像,点 样,在DNA样品中加入 Loading Dye混匀。 Sample 1：取自提DNA 5ul +2ul Loading Dye Sample 2: -DNA / Hind III 20ul +4ul Loading Dye 用加样器吸取样品点入点样孔： Sample 1：7ul Sample 2: 15ul,点样前先安排好各点样孔的样品，做好纪录，然后依次从右下角开始按顺序点样。,提 示,电 泳,接通电源，200v恒压电泳1小时。,染色和观察,切断电源，取出胶模，将凝胶置入EB染色液中染色10-15分钟。 取出凝胶，置于紫外灯下观察DNA电泳带型。,警告,胶染色和观察时一定要带手套！,EB（溴化乙锭） 诱变！,提 示,将凝胶旋转180o，置于紫外灯下观察DNA电泳带型。,1 自提DNA 2-DNA / Hind III 3-DNA,结果记录与分析,绘制电泳图谱,-DNA / Hind III Markers,-DNA / Hind III Markers 是利用EcoR I 彻底降解-DNA 后再进行内切酶的灭活处理和乙醇沉淀制备的。 贮藏缓冲液： 10mmol/L Tris-HCl (pH7.5), 10mol/L NaCl