SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

1、SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳这项技术自1967年Shapiro成立以来，于1969年被Weber和Osborn进一步完善。一、原则聚丙烯酰胺凝胶是一种网状立体结构的凝胶，由丙烯酰胺(Acr)和交联剂n，n-甲基双丙烯酰胺(Bis)的催化作用下交联而成，并作为支撑物电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳根据蛋白质分子携带的电荷的差异和分子大小不同，根据不同的迁移率将蛋白质分成多个带，如果分离和精制的样品只包含相同的蛋白质，那么在蛋白质样品电泳后只需分离一个带。SDS使负离子表面活性剂干扰蛋白质的氢键和疏水结合，按一定比例与蛋白质分子结合，使蛋白质具有远超过原电荷的负电荷，从而掩盖了各种蛋白质分子之间的自然电荷

2、差异。因此在电泳过程中，各种蛋白质-SDS复合物的迁移率不再受原始电荷和分子形状的影响，只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。因为SDS-page在电泳过程中找到了一些消除或减少蛋白质电荷差异的方法，所以常用于确认分离蛋白质样品的纯化程度，如果蛋白质样品由一个蛋白质或分子量相同的子基四级结构的一个蛋白质组成，则SDS-PAGE中只会出现一个蛋白质带。SDSPAGE可以分为磁盘和垂直板、连续系统和离散系统。本实验采用垂直板间断系统。所谓“不连续性”，是指电泳体系由两个或多个缓冲液、pH、凝胶孔径等组成。样品的浓度效应在不连续电泳系统中，上/下水箱缓冲(T

3、ris-Gly，pH8.3)，浓胶缓冲(tris-HCl，pH6.8)，分离胶缓冲(tris-HCl，pH8.8)，以及在此条件下，缓冲系统的HCl几乎大部分分解为cl-，两个插槽的Gly (pi=6.0，pK a=9.7)向Gly的负离子很少，酸性蛋白质也从负离子中分离。这些离子在电泳过程中转移到阳极。C1-速度最快(原子离子)，蛋白质次之，Gly负离子最慢(尾随离子)。C1很快超过了蛋白质离子，因此在其后，电导率低，电位梯度形成陡区，这一区域由于电泳过程中形成的电位梯度的不连续性，蛋白质和Gly离子的移动速度加快，结果是蛋白质进入分离胶之前在快速缓慢的离子之间浓缩成薄层，有助于提高电泳的分

4、辨率。分子筛效果蛋白质离子进入分离胶后，条件发生了很大变化。因为PH值高(电泳经常超过9.0)，所以将Gly分解为负离子的效果增加。随着凝胶浓度的提高，蛋白质的游泳受到影响，移动率急剧下降。这两种变化使Gly移动超过蛋白质，上述高压梯度不再存在，蛋白质在更均匀的pH和电压梯度环境中根据分子大小移动。分离胶的孔径有一定的大小，对于不同分子质量的蛋白质，通过时阻断的程度不同，即使是正电荷相同的粒子，也可以因为这个分子筛的效果，使不同大小的蛋白质相互分离。二、注意事项1.SDS和蛋白质的结合与质量成正比(即1.4gSDS/g蛋白)，蛋白质含量不能超过，否则SDS结合量不足。2.用SDS-聚丙烯酰胺凝

5、胶电泳测定蛋白质相对分子质量，也应作为标准曲线。这次标准曲线不能用于以下用途。而且SDS-页面测量分子量有10%的误差，完全不可靠。3.有些蛋白质由亚基(如血红蛋白)或两个或多个肽链(-胰凝乳酶)组成，在巯基乙醇和SDS的作用下，从亚基或多个单肽链中分离出来。因此，对于这种蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳只测定了小单位或单肽链的相对分子量。4.某些蛋白质(如电荷异常或结构异常的蛋白质；较大的蛋白质)不能用这种方法测量相对分子量。5.如果这个电泳出现拖尾、染色带背景不明确等现象，可能是SDS不纯的原因。步骤：组装两块洗净的玻璃板，浅玻璃板向外，牢固固定，检查漏水。根据蛋白质分子量，确定下胶浓度

6、，放置下胶，在小烧杯中摇晃，沿玻璃板之间的缝隙慢慢移植，将空气封闭到前玻璃板沿1.5厘米的位置，促进凝胶聚合，等待约15-30min，界面有明显的折叠光，倾斜模具，界面保持不变，适合凝胶。浓缩胶水、混合、移植、梳理插入、确保无气泡、等待凝胶完全聚合(约30分钟)；小心地拉梳子，将玻璃板固定在电泳框架(浅玻璃板内部)上，将整个电泳框架放入电泳槽内，将5电泳缓冲液倒入内、外槽内，使内槽水平通过前玻璃板；在蛋白质样品中加入样品缓冲液，混合，在沸水中加热10分钟左右，使蛋白质完全变质，在7-8l样品中取样，在蛋白质马尔库5 l中取样；连接正极和负极电线，电流为20毫安培，一半以上转换为35毫安培，溴酚蓝到达